洛铂对喉癌细胞株Hep-2作用的初步探讨

论文摘要

目的:喉癌是危害人类健康和生命的恶性肿瘤,手术及放疗为其主要治疗手段,但手术后患者喉失去原有的发音功能,很大程度影响喉癌病人的生活质量及生存率。近年来随着化疗水平的提高,化疗在喉癌的综合治疗中越来越占有重要的地位,比如喉癌的新辅助化疗,其目的在于缩小肿瘤、使临床分期提前、与放疗或喉部分切除术结合尽可能保留喉的发音功能。喉癌因位置隐蔽,发现时往往已到中晚期,晚期喉癌或经手术后出现复发的患者再次手术较为困难,单纯放疗只针对局部病灶,难以收到理想的效果,临床上即给予化疗,以控制肿瘤的全身转移,缓解症状,延长生命。铂类是头颈部化疗的基础用药,以顺铂（cDDP）为基础的化疗在头颈部肿瘤治疗中研究较多,并取得了一定的疗效,由于顺铂严重的肾毒性和消化道副作用限制了它在临床的应用,因此开发高效低毒的铂类制剂一直是学者们研究的方向。洛铂是第三代铂类衍生物,洛铂以其较轻的毒副作用、与顺铂不完全交叉耐药以及较强的抗肿瘤活性,已初步显示了其在肿瘤治疗中的重要作用。本实验以喉癌细胞株Hep-2为模型,采用倒置显微镜、MTT比色法、流式细胞技术检测洛铂对喉癌细胞的增殖、周期阻滞、诱导细胞凋亡等作用,应用免疫细胞化学法检测凋亡相关蛋白bcl-2的表达,初步探讨洛铂对喉癌细胞的增殖抑制、细胞周期改变、诱导细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达等方面的作用,为洛铂在头颈部肿瘤化疗中的应用提供实验依据。方法:1以对数生长期的喉癌细胞进行实验,将实验分组为:①空白对照组（培养液）;②阴性对照组（细胞+培养液）;③实验组（细胞+不同浓度洛铂+培养液）;将各组分别培养24、48、72小时。2倒置显微镜下观察细胞生长情况及细胞形态学改变。3应用MTT比色法检测洛铂对喉癌细胞的增殖抑制情况。4应用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率的改变。5应用免疫细胞化学法（S-P法）检测bcl-2蛋白表达的变化。6统计学处理:采用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理。数据分析时先行正态性检验,符合正态分布计量资料用均数±标准差（x+s）表示。组间比较先进行方差齐性检验,符合方差齐性后采用单因素方差分析的方法进行,如差异有显著性,进一步LSD法进行两两比较。两样本均数的比较用t检验,显著性水平以p﹤0.05为有统计学意义。结果:1相差显微镜下每日观察对照组和各实验组细胞大小和形态的变化。阴性对照组Hep-2细胞为上皮样,贴壁生长于培养基质,轮廓清晰,细胞间结构紧密,生长旺盛。5μmol/L洛铂作用48h后可见少量细胞体积增大、变圆,仍贴壁生长。20μmol/L时贴壁生长细胞逐渐减少,变圆细胞逐渐增多,脱壁漂浮的小圆球细胞及细胞碎片逐渐增多,到80μmol/L高浓度药物作用后贴壁生长细胞极少,出现成堆漂浮的死亡细胞及细胞碎片2洛铂对细胞增殖的影响:不同浓度洛铂在同一时间A值与对照组比较, 5μmol/L洛铂作用24小时与对照组无统计学意义,其余各组与对照组比较差异均有统计学差异（p<0.05）。同一浓度洛铂作用24、48、72小时比较差异均有统计学意义（p<0.05）。洛铂能明显抑制喉癌细胞的增殖,抑制率随着药物浓度的增加而增加,有剂量依赖关系;抑制率并随着药物作用时间的延长而增加,有时间依赖关系。但是到达一定抑制率（80%左右）后,再增加洛铂药物浓度,抑制率增加并不明显,呈现平台效应。3洛铂对细胞周期的影响:同一浓度洛铂作用24、48、72小时S期及G0/G1期与对照组比较差异均有统计学意义（p<0.05）。5μmol/L洛铂作用24小时开始引起喉癌细胞S期比例增加,随着作用时间延长到72小时时S期细胞比例下降,G0/G1期细胞比例增加。20μmol/L洛铂作用24小时使细胞阻滞在S期,阻滞作用明显,随着作用时间延长,S期细胞比例下降,随后出现明显的G0/G1期阻滞,表明低浓度短时间内使喉癌细胞阻滞在S期,高浓度长时间可使喉癌细胞阻滞在G0/G1期。4洛铂对细胞凋亡率的影响:正常对照组细胞无凋亡峰出现,5μmol/L洛铂作用24小时后有小的凋亡峰出现,作用48、72小时后出现明显的凋亡峰,20μmol/L作用24、48小时均出现明显的凋亡峰。不同浓度洛铂作用于喉癌细胞24、48、72小时的凋亡率差异均有统计学意义（p<0.05）,同一浓度洛铂对喉癌细胞作用24小时、48小时凋亡率差异有统计学意义（p<0.05）。结果表明洛铂可以诱导喉癌细胞凋亡,而且随着药物浓度和作用时间的增加,凋亡率逐渐增加,洛铂诱导喉癌细胞的凋亡呈时间和剂量依赖关系,低剂量洛铂（5μmol/L）24小时即可诱导喉癌细胞出现凋亡。5应用免疫细胞化学法（S-P法）检测各组细胞bcl-2蛋白表达的变化;20μmol/L洛铂作用48小时后,bcl-2表达减弱,经t检验p<0.05,差异有统计学意义。结论:1洛铂在体外具有抑制喉癌细胞增殖的作用,呈时间和剂量依赖性。2洛铂可以对喉癌细胞产生细胞周期阻滞,低浓度短时间阻滞在S期,高浓度长时间可产生G0/G1期阻滞。3洛铂能诱导喉癌细胞发生凋亡,呈时间和剂量依赖性, 5μmol/L浓度洛铂24小时即可诱导喉癌细胞凋亡。4洛铂可能是通过下调bcl-2的表达,而诱导喉癌细胞凋亡这可能是洛铂诱导凋亡的作用机制之一。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 洛铂对喉癌细胞株 Hep-2 作用的初步探讨
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 参考文献
• 综述 洛铂在临床治疗中的应用
• 致谢
• 个人简历