论文摘要
Apidaecin型抗菌肽指由昆虫细胞诱导表达的一类富含脯氨酸（Pro-rich）的、长度为18-20个氨基酸的抗菌肽,是目前已知的最大的Pro-rich抗菌肽家族。Apidaecin特异地作用于G-菌,在替代抗生素和抗感染方面显示出良好的应用潜力。本研究通过CD谱对apidaecin的结构进行了阐析,深入研究了apidaecin作用于G-菌的作用靶位点及其N-端和C-端基团的功能,并在构建乳酸乳球菌分泌表达载体的基础上,实现了apidaecin在乳酸乳球菌中的诱导、分泌表达。主要研究内容和结果如下:1.Apidaecin功能基团及其作用靶位点的分析通过固相肽合成方法合成了apidaecin及其N-末端和C-末端片段,对其功能基团及与目标蛋白DnaK作用的靶位点进行了研究。对apidaecin及其N-末端和C-末端的功能分析表明,apidaecin能够迅速进入E.coli细胞、显著抑制细胞胞内的β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶活性,并能够明显增强DnaK蛋白的ATPase活性,而其两个末端结构都不能进入E.coli细胞。这表明,apidaecin的N-末端和C-末端都不含有与进入细胞和与靶蛋白相互作用的特定结构。通过CD谱分析研究了apidaecin与DnaK蛋白的D-E螺旋片段和Lidless DnaK蛋白的相互作用,结果显示,apidaecin能够与Lidless DnaK蛋白,即DnaK蛋白的基质结合位点作用,而不与DnaK蛋白的D-E螺旋片段作用。以上结果提示,apidaecin可能通过与DnaK蛋白的基质结合位点结合,并通过与基质竞争该位点而降低DnaK蛋白在细胞内的实际浓度,从而抑制E.coli的β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶的活性,最终抑制细胞正常代谢而死亡。基于双相电泳的蛋白表达图谱的初步研究表明,经apidaecin处理的E.coli K88的蛋白表达谱与未处理的蛋白存在9个有意义的差异蛋白质点,其中4个蛋白质表达下调,4个蛋白质表达上调,呈“全或无”改变的蛋白质点1个。以上结果将为富含Pro的抗菌肽的作用机理的研究提供重要的理论依据。2.Apidaecin对哺乳动物Caco-2细胞和罗非鱼上皮细胞安全性评价分离和培养了尼罗罗非鱼（Oreochromis nilotica）肠道上皮细胞,并分别研究了三个浓度的apidaecin（10μg/ml,20μg/ml和30μg/ml）对哺乳动物Caco-2细胞（共培养1h）和罗非鱼肠道上皮细胞（分别共培养24h和48h）生长形态、增殖、存活率、通透性、胞浆游离Ca2+和磷脂酶A-2活性等相关指标的影响。研究结果表明:10-30μg/ml浓度范围内的apidaecin体外对哺乳动物细胞和鱼的肠道细胞都没有显著影响（P＞0.05）。该研究结果将为apidaecin在抗菌及替代抗生素方面的应用提供科学依据。3.Apidaecin在乳酸乳球菌中的分泌表达根据乳酸乳球菌（Lactococcus lactis,L.lactis）分泌表达规律,以Usp45信号肽作为信号肽序列,成功地构建了乳酸乳球菌分泌型表达载体sPNZ8048。将抗菌肽apidaecin基因克隆到sPN8048载体中,构建分泌型重组乳酸乳球菌表达载体sPNZ8048-ap,转化L.lactis受体菌NZ9000,得到重组菌L.lactis[spNZ8048-ap】。在nisin诱导、PnisA启动子的调控和Usp45信号肽的正确引导下,apidaecin成功地分泌表达。Tricine SDS-PAGE显示表达的apidaecin分子量为2.0kDa左右,表明Usp45信号肽序列经正确的翻译后加工而切除。发酵上清液经分子量截至1000-3000超滤膜浓缩、Sephacryl-S-100 HR填料的凝胶柱凝胶过滤及C18 vyrdac column的RP-HPLC纯化获得了具有抑菌活性的表达产物。L.lactis[spNZ8048-ap]诱导培养液上清及其纯化产物的Tricine SDS-PAGE凝胶电泳均得到了目的大小的条带,纯化蛋白的ESI-MS/MS质谱图谱在979.5.0 m/z得到了一个大的分子离子信号峰[M+2H+]2+,即分子量为1957.0 Da,与apidaecin的分子量大小一致（1957.3 Da）。在10 ng/ml的nisin诱导表达4h的前提下,1 L的apidaecin基因工程菌可以表达大约10 mg的重组apidaecin。纯化产物的抑菌活性试验显示,重组apidaecin具有明显的抑制大肠杆菌K88的活性。