桃叶珊瑚苷在大鼠糖尿病脑病模型中的作用及机制研究

论文摘要

本研究旨在探讨桃叶珊瑚苷在糖尿病脑病大鼠模型和过氧化氢（H2O2）诱导PC12细胞凋亡模型中的作用及机制。将Wistar大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ;60mg/kg）,建立糖尿病模型。糖尿病大鼠在正常饲养条件下,检测不同时期的大鼠血糖、体重,认知能力,海马神经元细胞的凋亡情况,确定糖尿病脑病发病时间。研究表明,STZ诱导形成的糖尿病大鼠饲养65d后表现出学习、记忆能力下降,海马CA1区神经元细胞大量死亡,因此糖尿病大鼠引发脑病时间确定为糖尿病发病后第65d。给患糖尿病脑病的大鼠腹腔注射不同剂量的桃叶珊瑚苷,确定桃叶珊瑚苷的药物剂量和药用时间,通过Y迷宫检测大鼠的认知能力,HE染色检测大鼠海马神经元细胞的凋亡情况。结果表明,1mg/kg桃叶珊瑚苷组与糖尿病脑病组相比具有一定的保护作用,大鼠的学习、记忆功能得到一定的改善。随着药物剂量的增加,其保护作用也增强。而5mg/kg和10mg/kg桃叶珊瑚苷组,海马CA1区存活神经元细胞数量与脑病组相比明显增多,大鼠学习、记忆功能得到很大程度的改善,但5mg/kg和10mg/kg两个剂量组之间无显著性差异。因此,以5mg/kg剂量对不同给药时间进行了检测,结果表明15d和30d两个剂量组之间无论在体重、血糖,还是在认知功能上均无显著性差异,故本实验确定桃叶珊瑚苷的给药剂量为5mg/kg,给药时间为15d。进一步运用电子显微镜、原位细胞死亡检测技术、免疫组化技术、Western blotting检测技术和紫外分光光度仪探讨桃叶珊瑚苷的神经保护作用机制。结果表明,糖尿病脑病大鼠的海马内GSH-PX、SOD和CAT酶活性显著降低,NOS酶和MDA活性明显增强,Bcl-2蛋白的表达减少,Bax蛋白表达和凋亡细胞数量均明显增加;而桃叶珊瑚苷治疗组海马内GSH-PX、SOD和CAT酶活力明显提高,Bcl-2蛋白表达量增加,抑制了NOS酶和MDA活性和Bax蛋白表达,大大降低了海马神经元细胞的凋亡数量。这些结果表明,桃叶珊瑚苷能够通过调控海马内抗氧化酶活性,清除海马内过多的自由基,通过调节NOS酶的活性,减少自由基的生成,降低体内自由基含量,并通过有效调节线粒体中Bcl-2和Bax蛋白的表达,从而抑制了海马神经元的细胞凋亡,最终实现对海马神经元细胞的保护。利用H2O2（0.25mM）诱导PC12细胞建立体外细胞凋亡模型之后,用桃叶珊瑚苷进行处理观察其对PC12细胞的作用。结果表明,桃叶珊瑚苷能够抑制H2O2对PC12细胞的毒性。荧光染色检测发现桃叶珊瑚苷治疗组与H2O2组相比细胞存活数量明显增多,凋亡数量明显减少;透射电镜观察H2O2处理组细胞呈现核固缩、胞质空泡化、但胞膜仍保持完整;桃叶珊瑚苷与H2O2共培养,细胞的形态只发生轻微变化;流式细胞仪分析细胞凋亡率,H2O2组为35.1±3.0%,桃叶珊瑚苷治疗组为23.1±1.1%;与H2O2组相比桃叶珊瑚苷治疗组的Bcl-2蛋白的表达明显增加,Bax蛋白的表达明显降低;Westernblotting检测结果与流式细胞仪分析结果相似;桃叶珊瑚苷治疗组的半胱氨酸酶-3活性明显降低;分光光度法检测LDH释放率的结果表明H2O2使得LDH的释放率明显增高,桃叶珊瑚苷有效缓解了LDH的释放。上述结果说明,桃叶珊瑚苷抑制H2O2诱导PC12细胞凋亡的机制,体现在保护细胞膜的功能,抑制Bcl-2蛋白表达的下降和Bax蛋白表达的升高,拮抗Caspase-3的激活。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 细胞凋亡与糖尿病脑病的关系
• 1.2 海马、学习记忆与糖尿病脑病
• 1.2.1 海马与学习记忆功能的关系
• 1.2.2 糖尿病脑病学习记忆功能的改变
• 1.3 糖尿病脑病的发病机制
• 1.3.1 脑血管改变
• 1.3.2 氧化应激和非酶性蛋白糖基化
• 1.3.3 兴奋性氨基酸毒性与钙超载
• 1.3.4 神经营养因子不足
• 1.3.5 自由基
• 1.4 糖尿病脑病模型
• 1.4.1 实验性糖尿病动物模型
• 1.4.2 自发性糖尿病动物模型
• 1.4.3 转基因动物
• 1.4.4 糖尿病脑病模型
• 1.5 糖尿病脑病的治疗进展
• 1.5.1 药物治疗
• 1.6 桃叶珊瑚苷的研究现状
• 1.6.1 植物抗生素
• 1.6.2 抗病毒作用
• 1.6.3 抗炎作用
• 1.6.4 抗氧化作用及延缓衰老作用
• 1.6.5 抗骨质疏松作用
• 1.6.6 神经营养作用
• 1.6.7 抗肿瘤活性研究
• 1.6.8 其他活性
• 参考文献
• 2 大鼠糖尿病脑病模型的构建
• 2.1 实验材料及设备
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验动物及饲养
• 2.2.2 配制试剂
• 2.2.3 实验动物的筛选与行为实验
• 2.2.4 糖尿病脑病模型的建立
• 2.2.5 桃叶珊瑚苷体内药物活性确定
• 2.2.6 桃叶珊瑚苷应用方案
• 2.2.6.1 桃叶珊瑚苷剂量效应
• 2.2.6.2 桃叶珊瑚苷长期给药效应
• 2.2.7 脑组织的处理及准备
• 2.2.8 脑组织病理染色（HE）
• 2.2.9 海马区存活细胞计数
• 2.2.10 统计学方法
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 糖尿病动物模型血糖、体重检测
• 2.3.2 糖尿病脑病模型的构建
• 2.3.3 HE染色检测观察海马CA1区神经元细胞
• 2.3.4 桃叶珊瑚苷剂量确定
• 2.3.5 桃叶珊瑚苷治疗后实验大鼠的体重、血糖检测
• 2.3.6 行为学检测
• 2.3.7 HE染色检测桃叶珊瑚苷对脑病鼠海马CA1神经元细胞的保护作用
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 参考文献
• 3 桃叶珊瑚苷在糖尿病脑病中神经保护作用机制探讨
• 3.1 实验材料及设备
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 实验动物分组、给药及饲养
• 3.2.2 海马CA1区存活神经元计数
• 3.2.3 透射电镜观察海马CA1区锥体神经元超微结构
• 3.2.4 原位细胞死亡检测凋亡神经元
• 3.2.5 免疫组化检测Bcl-2和Bax蛋白
• 3.2.6 组织蛋白测定
• 3.2.6.1 考马斯亮兰法
• 3.2.6.2 双缩脲法
• 3.2.7 Western blotting检测Bcl-2和Bax两种蛋白
• 3.2.8 超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）活力
• 3.2.9 谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase,GSH-PX）活力
• 3.2.10 过氧化氢酶（Catalase,CAT）活力
• 3.2.11 一氧化氮合成酶（Nitric Oxide Synthase,NOS）活力
• 3.2.12 丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量
• 3.2.13 统计学方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 电镜下海马CA1区神经元形态
• 3.3.2 海马CA1区存活神经元、TUNEL、Bcl-2和Bax阳性神经元计数
• 3.3.3 桃叶珊瑚苷对大鼠海马神经元细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响
• 3.3.4 SOD、GSH-PX和CAT的活性
• 3.3.5 MDA含量
• 3.3.6 NOS活性
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 参考文献
• 2O₂诱导PC12细胞凋亡的保护作用'>4 桃叶珊瑚苷对H₂O₂诱导PC12细胞凋亡的保护作用
• 4.1 实验材料及设备
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 PC12细胞培养
• 2O₂对PC12细胞的损伤'>4.2.2 H₂O₂对PC12细胞的损伤
• 2O₂对PC12细胞的损伤周期检测'>4.2.3 H₂O₂对PC12细胞的损伤周期检测
• 2O₂对PC12细胞的损伤形态学的观察'>4.2.4 H₂O₂对PC12细胞的损伤形态学的观察
• 2O₂对PC12细胞的损伤透射电镜观察'>4.2.5 H₂O₂对PC12细胞的损伤透射电镜观察
• 4.2.6 桃叶珊瑚苷对正常PC12细胞的毒性检测
• 2O₂对PC12细胞损伤的细胞活力检测'>4.2.7 桃叶珊瑚苷抑制H₂O₂对PC12细胞损伤的细胞活力检测
• 2O₂对PC12细胞损伤的形态学观察'>4.2.8 桃叶珊瑚苷抑制H₂O₂对PC12细胞损伤的形态学观察
• 2O₂对PC12细胞损伤的超微结构观察'>4.2.9 桃叶珊瑚苷抑制H₂O₂对PC12细胞损伤的超微结构观察
• 2O₂对PC12细胞损伤的细胞周期检测'>4.2.10 桃叶珊瑚苷抑制H₂O₂对PC12细胞损伤的细胞周期检测
• 4.2.11 蛋白质提取及分离
• 4.2.12 Western blotting
• 4.2.13 乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase,LDH）的释放
• 4.2.14 caspase-3分析活性
• 4.2.15 统计方法
• 4.3 实验结果
• 2O₂引起PC12细胞损伤的时间和剂量关系'>4.3.1 H₂O₂引起PC12细胞损伤的时间和剂量关系
• 2O₂对细胞周期的影响'>4.3.2 H₂O₂对细胞周期的影响
• 2O₂诱导PC12细胞凋亡'>4.3.3 Hoechst 33258染色观察H₂O₂诱导PC12细胞凋亡
• 2O₂诱导PC12细胞凋亡'>4.3.4 透射电镜观察H₂O₂诱导PC12细胞凋亡
• 4.3.5 桃叶珊瑚苷的细胞毒性检测
• 2O₂诱导PC12细胞凋亡细胞活力检测'>4.3.6 桃叶珊瑚苷抑制H₂O₂诱导PC12细胞凋亡细胞活力检测
• 2O₂诱导PC12细胞凋亡形态学观察'>4.3.7 桃叶珊瑚苷抑制H₂O₂诱导PC12细胞凋亡形态学观察
• 2O₂诱导PC12细胞凋亡超微结构观察'>4.3.8 桃叶珊瑚苷抑制H₂O₂诱导PC12细胞凋亡超微结构观察
• 2O₂诱导PC12细胞凋亡细胞周期检测'>4.3.9 桃叶珊瑚苷抑制H₂O₂诱导PC12细胞凋亡细胞周期检测
• 2O₂诱导PC12细胞凋亡乳酸脱氢酶释放率的测定'>4.3.10 桃叶珊瑚苷抑制H₂O₂诱导PC12细胞凋亡乳酸脱氢酶释放率的测定
• 4.3.11 桃叶珊瑚苷对Bcl-2家族蛋白表达的影响
• 4.3.12 桃叶珊瑚苷对Caspase-3活性的影响
• 4.3.13 Western blotting检测PARP蛋白的表达
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 参考文献
• 5 结论与创新点
• 5.1 结论
• 5.2 论文创新点
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 致谢