siRNA抑制hTERT及VEGF表达治疗鼻咽癌的实验研究

论文摘要

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国最为常见的头颈部恶性肿瘤，我国是世界上鼻咽癌的高发区，而国内又以广东、广西、湖南、福建和江西南方5省发病率最高。鼻咽癌的原发部位深而隐蔽，不易观察，与鼻腔、鼻窦及颅内毗邻，出现的早期症状各异，转移率高，易早期转移，常常容易误诊或漏诊，延误治疗。鼻咽癌的发病人群以30～50岁的青壮年多见，一旦发病，可对社会、经济和家庭造成较大影响。因此，鼻咽癌早期诊断及治疗的相关研究一直是我国耳鼻咽喉科研工作的重点。目前鼻咽癌的病因尚未完全明确，普遍认为其发病与EB病毒的感染、环境及遗传因素有关。鼻咽癌的治疗主要是以放射治疗为主，对中晚期鼻咽癌患者、鼻咽癌放疗后复发患者以及放疗效果欠佳的患者，可采取化学药物治疗，但仅属辅助性治疗或姑息性治疗。因受鼻咽腔部位隐蔽、腔道狭小、四周结构复杂、鼻咽癌低分化癌多见、易早期转移、难以完整切除等特点的限制，鼻咽癌的手术治疗仅仅在某些特殊情况下作为辅助方法采用。为了提高鼻咽癌的治疗效果，特别是为了解决对放疗不敏感、放疗后病灶残留或放疗后复发患者的治疗难题，国内外研究者近年来相继开展了各种生物治疗研究，包括主动及被动免疫治疗、基因治疗、抗肿瘤血管生成治疗、免疫调节剂和生物反应调节剂治疗等，取得了一定的成果，但仍还不能达到临床应用的水平，我们仍需要不断努力，寻找更有效的治疗手段。目前，依据肿瘤本身生物学特点及发生机制来制定基因治疗方案已成为肿瘤治疗的热点，尤其是RNA干扰技术在哺乳动物体内的应用，为包括鼻咽癌在内的肿瘤的基因治疗开辟了一个新的领域。端粒的长短与细胞寿命及增殖关系密切，端粒酶可以阻止端粒随细胞分裂而逐渐缩短，从而稳定染色体末端。端粒酶的激活可使细胞获得永生，研究表明，端粒酶活性与恶性肿瘤关系密切。绝大部分恶性肿瘤细胞包括鼻咽癌细胞在内均可检测到端粒酶的活性表达，而在正常组织和良性肿瘤端粒酶活性绝大部分为阴性，hTERT是端粒酶的活性亚单位，因此，hTERT基因是一个很好的鼻咽癌基因治疗的靶基因。血管内皮因子VEGF是唯一能特异作用于内皮细胞的有丝分裂原，与鼻咽癌局部复发、淋巴结转移、远处转移等有密切的联系。绝大多数恶性肿瘤中均呈现VEGF及其受体的高表达。研究表明，VEGF的高表达与肿瘤患者生存期及转移有关，即VEGF高表达者易转移，生存期短。鼻咽癌患者中VEGF阳性高的病人，区域淋巴结转移机会也高。目前利用VEGF基因开展抗肿瘤血管新生治疗越来越受到研究者的重视，恶性肿瘤中VEGF及其受体的协同表达，旁／自分泌作用机制的确立也为肿瘤的基因治疗提供了新的靶点。抑制VEGF及其受体，阻断VEGF与其受体相互作用，可以达到阻止肿瘤血管新生，抑制肿瘤生长转移的目的，目前，鼻咽癌相关研究中VEGF与鼻咽癌的关系以及VEGF在鼻咽癌治疗中的应用日益受到关注。RNA干扰是近年来发现的研究生物体基因表达、调控与功能的新技术，它利用了由小干扰RNA引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。它普遍存在于各种生物，是一种集经济、快捷、高效、特异性强等特点于一体的抑制基因表达的技术手段，可广泛用于基因功能测定及基因治疗等方面。本研究的目的是利用RNA干扰技术抑制hTERT基因和VEGF基因的表达，开展对鼻咽癌的基因治疗研究。整个研究内容分三部分进行，第一部分主要是siRNA的体外合成及鼻咽癌细胞内RNA干扰效应的观察，目的是确定针对hTERT基因和VEGF基因进行RNA干扰的有效作用位点，观察设计的sihTERT和siVEGF在鼻咽癌中的RNA干扰效应，为后续的质粒构建和体内实验奠定基础。通过利用在线网站的生物软件设计多个针对hTERT基因和VEGF基因的RNA干扰片段，利用体外转录法快速合成相应的siRNA，然后利用脂质体瞬时转染到鼻咽癌CNE-2细胞中，通过荧光显微镜观察、半定量RT-PCR、Western Blot、流式细胞学检查及TRAP-银染法观察RNA干扰效应，确定RNA干扰最佳作用位点。结果确定了hTERT基因和VEGF基因各2个有效作用位点，观察到对hTERT基因和VEGF基因的有效RNA干扰可以将对应基因的mRNA水平分别下调89％～92％、80％～95％，同时使其表达的蛋白水平下降。对hTERT基因的有效干扰还可以使肿瘤细胞增殖受到抑制，使其细胞周期受阻于G0～G1期，诱导肿瘤细胞凋亡。本研究的第二部分主要是针对第一部分确定的hTERT基因和VEGF基因RNA干扰的有效作用位点，设计并构建能在肿瘤细胞内表达siRNA的质粒载体。方法是利用pGenesil-1 Vector载体，分别构建针对hTERT基因的RNA干扰质粒pGenezil-hTERT、针对VEGF基因的pGenesil-VEGF质粒、同时针对上述两种基因的pGenesil-hTERT-VEGF质粒，然后将构建的质粒转染CNE-2细胞，通过RT-PCR、Western Blot、MTT法来观察RNA干扰效应，结果成功构建了pGenesil-hTERT、pGenesil-VEGF及pGenesil-hTERT-VEGF质粒，观察到上述质粒在CNE-2细胞可以表达siRNA，发挥RNA干扰效应。本研究第三部分主要是进行RNA干扰的裸鼠体内实验，为今后的临床实验奠定基础。方法是将裸鼠接种CNE-2细胞建立人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型，然后利用pGenesil-hTERT、pGenesil-VEGF及pGenesil-hTERT-VEGF质粒分别进行siRNA治疗鼻咽癌的基因治疗，通过显微镜下形态学观察、测量肿瘤大小绘制肿瘤生长曲线、TUNEL法计算肿瘤细胞凋亡指数以及免疫组化等方法，观察RNA干扰体内实验的效果，结果发现3种质粒都能有效地抑制裸鼠移植瘤的生长，促进细胞的凋亡，而pGenesil-hTERT-VEGF质粒的RNAi效应要强于其他2个质粒载体。本研究最后得到以下结论：（1）体外转录合成的siRNA可在鼻咽癌中发挥特异性的RNA干扰效应；（2）hTERT基因的位点的335～357、2324～2346，VEGF基因的1130～1152、1504～1526为RNA干扰的有效作用位点；（3）针对hTERT基因的有效RNA干扰可导致鼻咽癌肿瘤细胞生长缓慢，细胞增殖受抑，hTERT基因的mRNA水平下调，蛋白表达下降，端粒酶活性降低，细胞周期在G0～G1期受阻，并不同程度诱导细胞凋亡；（4）针对VEGF基因的有效RNA干扰可使VEGF基因mRNA水平下降，蛋白表达下调，但不抑制肿瘤细胞增殖，也不诱导肿瘤细胞凋亡；（5）利用pGenesil-1Vector载体成功构建了针对hTERT基因和VEGF基因的质粒载体pGenesil-hTERT、pGenesil-VEGF和pGenesil-hTERT-VEGF，均能在细胞中长期表达siRNA，起到RNA干扰作用；（6）成功建立了人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型；（7）pGenesil-hTERT、pGenesil-VEGF和pGenesil-hTERT-VEGF的裸鼠体内实验表明这3种质粒载体均能有效地抑制鼻咽癌肿瘤的生长，促进肿瘤细胞的凋亡，达到治疗鼻咽癌的目的；（8）首次联合干扰端粒酶逆转录酶基因hTERT和血管内皮生长因子基因VEGF成功地进行了鼻咽癌的基因治疗，证明联合干扰hTERT基因和VEGF基因的RNA干扰效果强于对单个基因的干扰效应，证实了联合抑制多个基因治疗肿瘤的可行性和有效性，为其它肿瘤的基因治疗探索了一条新的途径，这也是本研究最大的创新点所在。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 技术路线图
• 第一章 体外转录合成sihTERT及siVEGF在鼻咽癌细胞中的RNA干扰效应
• 1.1 材料
• 1.1.1 细胞
• 1.1.2 引物
• 1.1.3 主要试剂/试剂盒
• 1.1.4 主要仪器及设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 体外转录合成sihTERT及siVEGF
• 1.2.2 siRNA瞬时转染CNE-2细胞
• 1.2.3 sihTERT转染CNE-2细胞后的RNA干扰效应观察
• 1.2.4 siVEGF转染CNE-2细胞后的RNA干扰效应观察
• 1.2.5 统计学处理
• 1.3 结果
• 1.3.1 体外转录合成siRNA
• 1.3.2 siRNA转染效率
• 1.3.3 sihTERT转染CNE-2细胞后的RNA干扰效应
• 1.3.4 siVEGF转染CNE-2细胞后的RNA干扰效应
• 1.4 讨论
• 1.4.1 RNA干扰在肿瘤治疗中的应用
• 1.4.2 sihTERT和siVEGF有效干扰位点的确定
• 1.4.3 siVEGF和siVEGF在鼻咽癌CNE-2细胞的RNA干扰效应
• 第二章 表达sihTERT及siVEGF质粒的构建及鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 细胞
• 2.1.2 质粒和细菌
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 主要试剂/试剂盒
• 2.1.5 主要仪器及设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 表达sihTERT及siVEGF质粒的构建
• 2.2.2 shRNA质粒转染鼻咽癌细胞及鉴定
• 2.2.3 统计学处理
• 2.3 结果
• 2.3.1 质粒的构建
• 2.3.2 构建质粒的感染效率
• 2.3.3 构建质粒的RNA干扰效应
• 2.4 讨论
• 第三章 SihTERT及siVEGF表达质粒裸鼠体内实验研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 细胞及裸鼠
• 3.1.2 质粒
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 裸鼠鼻咽癌动物模型的建立
• 3.2.2 shRNA表达质粒转染裸鼠鼻咽癌动物模型
• 3.2.3 shRNA质粒转染裸鼠鼻咽癌动物模型后生物学效应观察
• 3.2.4 统计学处理
• 3.3 结果
• 3.3.1 裸鼠鼻咽癌动物模型的建立
• 3.3.2 转染质粒对裸鼠移植瘤生长的影响
• 3.3.3 质粒转染情况
• 3.3.4 病理学检查
• 3.3.5 蛋白表达检测
• 3.3.6 MVD检测
• 3.3.7 凋亡检测
• 3.4 讨论
• 3.4.1 鼻咽癌的基因治疗
• 3.4.2 sihTERT和siVEGF体内实验初步研究
• 第四章 结论
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果