论文摘要
一、研究的目的和意义系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种常见的自身免疫性疾病,可引起全身各个脏器的损害,而肾脏损害最为常见,称之为狼疮性肾炎（lupus nephritis,LN）。LN的类型必须通过肾脏穿刺行病理检查后,才能确诊。该项检查属于创伤性检查,且其受患者病情、医疗条件等的限制,有些LN患者不能接受肾脏病理检查。因此,我们希望能够通过患者临床表现以及一些非创伤性的检查结果,初步判断出LN患者肾脏病理类型,以给疾病的治疗提供一定的依据,并减轻患者的痛苦。另外,在狼疮患者肾脏损害的发病机理上,由于LN是一种长期慢性的自身免疫性疾病,具有多种自身抗原,诱发多种自身性抗体,因而所形成的免疫复合物的性状也不单一,参与的免疫球蛋白有IgG、IgA和IgM,而且沉积的强度均较强。通过经典途径激活补体也是其特点之一,而Clq是补体经典途径第一补体成分Cl的一个亚基,是补体经典途径激活的始动因素。近来研究发现Clq与SLE发病有一定关系,目前两者之间的关系的研究,往往通过血液检查来实现,并不能直接反映出沉积在肾脏的Clq与疾病之间的关系,而此方面的研究尚未见报道。因此,我们希望通过肾脏病理检查,以了解二者之间的关系,为进一步了解Clq和SLE发病机制之间的关系提供依据。有关SLE和LN的治疗上,为了改善病情除了常规使用激素以外,往往需要加用免疫抑制剂或细胞毒药物等,其中,环磷酰胺（Cyclophosphamide,CTX）和霉酚酸酯（Mycophenolate Mofetil,MMF）是这类药物的代表。在临床工作中,CTX是治疗LN的主要传统药物,不仅价格上十分便宜,治疗效果上也相对较好,其对患者病情的缓解,对肾脏损害的改善,提高患者生存质量都受到了肯定。但其毒副作用较多而且较重,从而使CTX的使用受到一定限制。随着MMF在LN中的使用,LN的治疗有了一定程度上的改善。有许多报道说明,其在治疗效果和副作用的发生机会及严重程度上,多优于CTX。但是,我们在临床工作中观察看,MMF的治疗效果与CTX比较,并不像文献报道的效果那样好。为了进一步深入了解两者之间的疗效和安全性,我们采用目前在世界范围内临床疾病诊治中多主张使用的循证医学（evidence-based medicine,EBK）方法对其进行研究。在循证医学的具体方法上,我们选择使用Meta分析的方法,进行MMF和CTX治疗LN的有效性和安全性比较评价。Meta分析是对相同目的、性质相近的多个医学研究所进行的一种定量综合分析,不是一种简单的统计方法,是包括提出问题、制定纳入和排除标准、检索相关研究、汇总基本信息、综合分析并报告结果等在内的一系列过程。在LN肾炎的类型选择上,我们以弥漫增生性狼疮肾炎（diffuse proliferative lupus nephritis,DPLN）为研究对象。DPLN不仅是临床上最为常见的LN类型之一,而且针对DPLN治疗的Meta分析研究尚未见报道,具有普遍的代表性和创新性。近年来,随着治疗狼疮的药物和新技术不断发展,大大提高了狼疮患者的生存率和生活质量。不可否认的是,狼疮患者本身免疫力低下,加上激素以及各种治疗狼疮的免疫抑制剂（如上述的MMF和CTX）的使用,同时新技术中如自体造血干细胞移植（autologous hematopoietic stem cell transplantation,AHSCT）的过程中,需要超大剂量的CTX等药物,进一步造成了狼疮患者免疫力低下,更容易合并各种病原微生物（如病毒、细菌及真菌等）的感染。当狼疮患者合并深部真菌感染时,不仅症状不典型,造成治疗上的矛盾,而且确诊需要真菌培养来实现,有时患者可能合并不止一种真菌感染,可能多种,不仅花费时间长,而且对于感染的程度不能进行定量分析。由此,我们希望能有一种技术,可短时间内、定量,且能同时检测多种真菌菌种的技术,以实现狼疮患者合并深部真菌感染的诊断。多重荧光定量PCR（multiplex fluorescentquantitative PCR,MFQ-PCR）是近年来新发展起来的新型诊断技术。他的优点是通过设计多条探针和检测一份标本,可以同时对不同种类微生物进行检测,这种检查技术可以几分钟内显示结果,并可定量地监测感染的程度,对于判断病情的轻重十分有利。目前此项技术在SLE患者合并深部真菌感染等方面,国内外尚未有报道。如果此项技术获得成功,将有望为临床的诊治工作,带来一定的突破。我们将常见的深部真菌白念珠菌和黄曲霉做为监测对象来进行研究。二、研究的方法和内容1系统性红斑狼疮临床特征、肾脏病理和Clq之间关系的研究1.1选取行肾脏穿刺活检和肾脏免疫荧光病理检查的SLE住院患者。将其分为Ⅳ型前LN组、Ⅳ型LN组和Ⅴ型LN组三组,观察各组SLE患者的临床表现、实验室检查等,以研究系统性红斑狼疮临床表现与肾脏病理之间的关系。1.2根据病理结果再分为Clq阳性组和Clq阴性组,以探讨Clq与临床表现和肾脏病理之间的关系。2霉酚酸酯与环磷酰胺治疗弥漫增生性狼疮肾炎Meta分析计算机检索PUBMED和中国期刊网（China National KnowledgeInfrastructure,CNKI）和中国生物医学（Chinese Biomedical Database,CBM）等数据库,并手工检索肾脏病学、风湿病学、皮肤病学等16种医学杂志,收集MMF比较CTX治疗弥漫增生性狼疮肾炎的随机对照实验,使用Meta分析的方法评价治疗的有效率、复发率、死亡率、24h尿蛋白定量、血肌酐水平、肾组织学活动性指数、肾组织学慢性化指数、感染、白细胞减少、闭经和腹泻等情况。从而探讨MMF与CTX治疗DPLN的有效性和安全性。3 SLE合并深部真菌感染的多重荧光定量PCR检测研究通过美国细胞、菌种库（american type culture collection,ATCC）公布的白念珠菌及黄曲霉的基因序列,应用分子生物学软件设计两对引物和Taqman探针,并对荧光定量PCR反应条件进行优化,通过检测狼疮患者合并深部真菌感染样品20例,以了解该法阳性率。通过多重荧光定量PCR法和真菌培养法分别检测怀疑深部真菌感染的SLE样品20例,以及使用PCR法检测非白念珠菌及非黄曲霉微生物样品20例,分别对该法的敏感性、特异性进行评价。三、研究结果1系统性红斑狼疮临床特征、肾脏病理和Clq之间关系的研究1.1系统性红斑狼疮临床特征、肾脏病理之间关系不同类型。肾脏病理SLE患者间,关节痛、蝶形红斑、光敏感、高血压、抗ds-DNA、HGB下降、补体减低、BUN增高、Cr增高、血尿、尿蛋白（3+）、24h尿蛋白定量（＞0.5）、尿C3、尿α-M、尿溶菌酶、尿NAG、Clq阳性的发病率有统计学意义（p＜0.05）;1.2 Clq阳性与临床特征、肾脏病理之间的关系1.2.1将肾脏病理类型纳入Logist回归研究中得到回归方程LogitP1=0.777+1.884X1+1.630X2,X1及X2分别代表Ⅳ型LN和腹水,其OR值分别6.582和5.102,方程相关系数R2=0.521;该方程总判对率为76.7%,灵敏度为94.8%;1.2.2将肾脏病理类型不纳入logist回归研究中得到回归方程LogitP2=3.296-1.667X1+1.425X2+1.209X3,X1～X3分别代表性别、腹水及C4下降,其OR值分别0.189、4.160及3.350;方程相关系数R2=0.471;该方程总判对率为80.7%,灵敏度为90.5%。2霉酚酸酯与环磷酰胺治疗弥漫增生性狼疮肾炎Meta分析共有10篇文献纳入研究。在治疗DPLN患者的疗效方面,如缓解情况、复发情况、死亡情况、24小时尿蛋白定量和血肌酐下降情况（治疗后3月、6月及12月）,MMF组和CTX组之间无明显差别;而AI指标改善,MMF组较CTX组效果好,在感染、白细胞减少、闭经等的发生等方面,MMF组较CTX组机会低,且有统计学意义（P＜0.05）。3 SLE合并深部真菌感染的多重荧光定量PCR检测研究多重荧光定量PCR检测SLE合并白念珠菌和黄曲霉感染的阳性率及特异性均为100%;而多重荧光定量PCR法和真菌培养法敏感性分别为75.00%和40.00%,两方法敏感性比较有统计学差异（P＜0.05）。四、研究结论本研究第一部分显示,不同肾脏病理类型的SLE患者间临床特征存在某些程度差异,我们可以通过SLE患者临床表现及某些非创伤性检查,初步判断出患者肾脏损害的病理类型。而Clq在肾脏组织上的沉积的研究,我们发现,在行肾脏病理检查和不行肾脏病理检查的情况下,可分别使用两个方程,初步估算出Clq在肾脏沉积的可能性。这给临床医生工作带来了一定的便利,同时给患者减轻了一定的痛苦。我们还发现了一个现象,两方程中均有腹水做为自变量,且均为危险因素。说明对于伴有腹水LN患者,更易发生肾脏的Clq沉积。有关具体原因,有待我们进一步研究证实。通过我们第二部分循证医学研究发现,在安全性上,MMF与CTX比较,前者较后者为佳。然而,MMF在治疗DPLN疗效上,与传统的CTX比较,并不像目前文献报道的一样,而是仅AI指标改善,MMF组较CTX组效果好,而大部分疗效指标二者无明显差别。这对于指导我们临床治疗SLE工作,意义十分重大。有关第三部分的研究显示,基于Taqman探针技术的实时荧光PCR检测体系可同时检测SLE患者合并白念珠菌和黄曲霉深部真菌感染,具有快速、灵敏度高、特异性强、可定量等优点。如果此项技术应用于临床诊断,不仅在真菌诊断上将是一个较大的突破,而且也大大降低了患者的费用,同时提示我们可以进行进一步深入研究,将探针数量不断增加,以实现细菌、病毒及真菌的同时定量检测,这对于临床诊断工作,将是一个有力的推动。