小麦甲羟戊酸激酶基因克隆及功能分析

论文摘要

小麦面粉白度是磨粉品质的最重要指标之一,反映了小麦制粉精度,是划分小麦面粉等级的重要标准。长期以来,我国和亚洲其他一些国家和地区的人们偏爱由洁白的面粉制成的面条、馒头和水饺等食品,但小麦面粉中通常含有一定的类胡萝卜素等黄色素,导致小麦面粉自然白度达不到所需要求。为了满足人们的喜好以及提高小麦面粉产品的市场竞争力,几乎所有国内面粉企业都在面粉生产中加入面粉增白剂。然而,由于长期大量食用增白剂会危害人体健康,我国已经全面禁止面粉增白剂的使用。因此,从基因水平上深入研究影响小麦面粉白度的分子机制,选育自然粉色洁白的品种尤其是面粉白度高的强筋型小麦品种替代面粉增白剂,满足人们的口味,提高小麦面粉产品市场竞争力是育种工作者面临的新课题。小麦面粉中的类胡萝卜素等黄色素是通过甲羟戊酸代谢途径中一系列酶合成的,其中甲羟戊酸激酶是该代谢途径中三个连续ATP依赖酶中的第一个,是控制整个代谢途径的限速酶之一。本文根据不同物种甲羟戊酸激酶基因的序列信息设计引物,通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）和cDNA末端快速克隆（RACE）技术,从高白度面粉小麦品种济南13、面粉白度中等小麦中国春和面粉白度较低的玉麦中分离克隆了长度为1800 bp的甲羟戊酸激酶基因的cDNA,其编码区长度为1161 bp,编码387个氨基酸,5′端非编码区长度为273 bp,并且发现甲羟戊酸激酶氨基酸序列在面粉高白度小麦品种济南13和面粉白度较低的地方品种玉麦中出现6个重要氨基酸残基的差异。为进一步研究小麦甲羟戊酸激酶的功能,分别构建了小麦济南13和玉麦甲羟戊酸激酶基因的原核基因表达载体Mk::pLM1,并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行了基因表达。利用Hi-trag离子交换柱进行蛋白质分离纯化后,获得了可溶性的甲羟戊酸激酶。SDS-PAGE显示出一条约43 kD的蛋白条带,与预期大小基本一致。这为进一步研究甲羟戊酸激酶活性与小麦面粉白度的关系,以及为天然高白度优质小麦新品种选育奠定了坚实的基础。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 我国小麦面粉使用现状
• 1.2 小麦面粉白度的影响因素
• 1.2.1 小麦面粉中的天然色素
• 1.2.2 小麦面粉中的多酚氧化酶
• 1.2.3 种皮颜色、籽粒硬度等影响因素
• 1.3 小麦天然色素合成途径及其关键调控酶
• 1.3.1 类异戊二烯物质的生物合成
• 1.3.2 甲羟戊酸激酶的生物学特性
• 1.3.2.1 甲羟戊酸激酶的晶体结构
• 1.3.3 甲羟戊酸激酶基因克隆研究进展
• 1.3.3.1 微生物甲羟戊酸激酶基因的分子克隆
• 1.3.3.2 动物甲羟戊酸激酶基因的分子克隆
• 1.3.3.3 植物甲羟戊酸激酶基因的分子克隆
• 1.3.4 甲羟戊酸激酶基因的表达
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 仪器和药品
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 试剂及药品
• 2.2.2.1 质粒、工具酶和试剂
• 2.2.2.2 溶液的配制
• 2.3 方法
• 2.3.1 RNA提取
• 2.3.1.1 RNA的电泳检测
• 2.3.2 cDNA第一条链的合成
• 2.3.3 基因特异片段扩增
• 2.3.3.1 基因特异片段的引物设计
• 2.3.3.2 基因特异片段的PCR结果检测
• 2.3.3.3 扩增片段的回收
• 2.3.3.4 回收产物的电泳检测
• 2.3.3.5 PCR产物的连接
• 2.3.3.6 感受态细胞的制备
• 2.3.3.7 转化、培养
• 2.3.3.8 阳性重组子鉴定
• 2.3.3.9 阳性质粒的保种和质粒提取
• 2.3.3.9.1 质粒提取
• 2.3.3.10 重组质粒检测和测序
• 2.3.3.11 缺失验证
• 2.3.3.11.1 第五号质粒的PCR反应
• 2.3.3.11.2 PCR产物的纯化和电泳浓度检测
• 2.3.3.11.3 第五号质粒测序
• 2.3.4 通过RACE技术快速获得末端序列
• 2.3.4.1 RACE引物的设计
• 2.3.4.2 第一链cDNA的合成
• 2.3.4.3 RACE快速扩增末端序列
• 2.3.4.3.1 RACE PCR产物纯化
• 2.3.4.3.2 RACE PCR产物的连接转化
• 2.3.4.3.3 RACE PCR产物重组子的筛选
• 2.3.5 基因特异片段和RACE序列拼接全长序列
• 2.3.6 Mevalonate kinase全长序列的扩增
• 2.3.6.1 Mevalonate kinase全长引物的设计
• 2.3.6.2 全长基因的PCR扩增
• 2.3.6.3 全长PCR产物的测序
• 2.3.7 甲羟戊酸激酶的原核表达
• 2.3.7.1 原核表达引物设计
• 2.3.7.2 原核表达序列的PCR扩增
• 2.3.7.3 甲羟戊酸激酶原核表达序列PCR扩增产物的酶切
• 2.3.7.4 酶切产物的连接和转化
• 2.3.7.5 阳性克隆重组子的PCR鉴定、酶切鉴定及质粒提取
• 2.3.7.6 甲羟戊酸激酶蛋白表达条件的优化
• 2.3.7.6.1 IPTG浓度的优化
• 2.3.7.6.2 诱导温度的优化
• 2.3.7.7 甲羟戊酸激酶蛋白的大量表达
• 2.3.8 蛋白的纯化
• 2.3.9 SDS-PAGE电泳检测蛋白质
• 2.4 纯化蛋白的透析
• 第三章 结果与分析
• 3.1 小麦RNA的电泳检测
• 3.2 济南13号基因特异片段PCR产物检测
• 3.3 RACE快速末端PCR扩增结果和RACE菌液PCR鉴定
• 3.4 MVK全长基因序列的扩增及基因性质分析
• 3.4.1 小麦甲羟戊酸激酶全长基因的克隆
• 3.4.2 小麦甲羟戊酸激酶基因的特性分析
• 3.5 MVK开放阅读框的扩增和酶切
• 3.6 中国春、玉麦、济南13表达载体的构建和酶切验证
• 3.7 甲羟戊酸激酶蛋白表达条件的优化
• 3.8 甲羟戊酸激酶蛋白表达产物的纯化
• 第四章 讨论
• 4.1 分离纯化高质量的植物RNA是克隆目的基因的关键
• 4.2 甲羟戊酸激酶基因的克隆和原核表达
• 4.3 高白度面粉小麦与低白度面粉小麦MVK重要氨基酸残基的差异
• 参考文献
• 已发表的文章
• 致谢