Pseudomonas mosselii E1和P.pseudoalcaligenes B50铁载体合成相关基因的克隆及功能初步分析

论文摘要

从棉花根际筛选到铁载体产生细菌B50和E1。通过形态观察、生理生化鉴定,B50和E1都是革兰氏阴性无芽孢杆菌,属于假单胞菌属,16S rDNA测序结果表明, B50的16S rDNA序列与Pseudomonas pseudoalcaligenes的同源性为100%,E1的16S rDNA序列与Pseudomonas mosselii的同源性为100%。用抗生素平板法对P. pseudoalcaligenes B50和P. mosselii E1进行药敏试验,B50和E1都对卡那霉素敏感,能够耐受10μg/mL以上的氯霉素。利用转座子Tn5-1063a分别对E1和B50进行转座子插入诱变,筛选出2株E1铁载体合成缺失突变株:E1-185和E1-332;5株B50铁载体合成缺失突变株:B50-472、B50-982、B50-1358、B50-1657和B50-1723。根据转座子Tn5-1063a当中的luxA序列设计引物,分别以E1和B50总DNA、pRL1063a质粒DNA和突变株总DNA进行PCR扩增,测序,与已知的luxA序列进行比对,铁载体合成缺失突变株的luxA序列均与已知的luxA序列同源性为100%,由此证实转座子确实插入到E1和B50的基因组中。根据转座子Tn5-1063a两端的序列分别设计3个嵌套引物,同时设计了7个随机引物,用TAIL-PCR（Thermal asymmetric inter laced PCR）方法,从突变株E1-185中克隆到铁载体合成相关基因cysI。cysI与半胱氨酸合成有关,在非核糖体肽类型的铁载体合成过程中,参与酰基硫载体蛋白（acyl-S-PCPs）的合成,是铁载体合成过程中的关键步骤,并进行了验证试验。从突变株B50-1657中克隆到铁载体合成相关基因pyrD。pyrD编码二氢乳清酸脱氢酶,催化S-二氢乳清酸到乳清酸的转化,是嘧啶合成的第四步。通过试验证实,pyrD与铁载体的合成有关。此外,还从突变株B50-1358中克隆到铁载体合成相关基因relA的部分序列。relA编码严谨控制因子RelA/SpoT,调控（p）ppGpp的合成和水解。严谨控制是细菌在营养贫瘠的环境下生长时产生的一种应激反应,培养基中有效铁含量的不足引起细菌的严谨控制反应,诱发铁载体的产生。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 绪论
• 1.1 铁的生理机能和铁的生物有效性
• 1.2 微生物铁载体的作用
• 1.3 微生物铁载体的种类与结构
• 1.4 微生物铁载体的合成及相关基因
• 1.4.1 微生物铁载体的合成过程
• 1.4.2 pyochelin 的合成及相关基因
• 1.4.3 pyoverdin 的合成及相关基因
• 1.4.4 enterobactin 的合成及相关基因
• 1.4.5 vibriobactin 的合成及相关基因
• 1.4.6 anguibactin 的合成及相关基因
• 1.4.7 yersiniabactin 的合成及相关基因
• 1.4.8 影响微生物铁载体合成的因素
• 1.5 微生物从铁载体获取铁的机制
• 1.6 微生物铁载体的研究方法
• 1.7 转座子诱变
• 1.8 本研究的目的意义
• 1.9 研究内容、技术路线及方法
• 第二章 Pseudomonas pseudoalcaligenes B50 和Pseudomonas mosseliiE1 的鉴定及其铁载体合成缺失突变株的筛选
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 菌株与质粒
• 2.2.2 培养基与培养液
• 2.2.3 实验试剂
• 2.2.4 方法
• 2.2.4.1 铁载体产生菌 B50 和 E1 的生理生化鉴定
• 2.2.4.2 药敏试验
• 2.2.4.3 铁载体定性检测
• 2.2.4.4 转座子诱变
• 2.2.4.5 接合子的保存
• 2.2.4.6 基因组 DNA 的提取
• 2.2.4.7 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.4.8 DNA 凝胶回收
• 2.2.4.9 DNA 浓度的确定
• 2.2.4.10 铁载体产生菌的鉴定
• 2.2.4.11 PCR产物的纯化
• 2.2.4.12 碱裂解法小量提取质粒
• 2法制备新鲜的 DH5α感受态细胞'>2.2.4.13 CaCl₂法制备新鲜的 DH5α感受态细胞
• 2.2.4.14 luxA PCR 验证
• 2.2.4.15 PCR 产物克隆
• 2.2.4.16 克隆中插入片断的验证
• 2.3 结果
• 2.3.1 棉花根际铁载体产生细菌的药敏试验
• 2.3.2 铁载体产生细菌的鉴定
• 2.3.3 铁载体合成缺失突变株的筛选
• 2.4 讨论
• 第三章 Pseudomonas mosselii E1 铁载体合成相关基因cysI 的克隆及功能初步分析
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株与质粒
• 3.2.2 培养基与培养液及试剂
• 3.2.3 方法
• 3.2.3.1 TAIL-PCR 引物的设计
• 3.2.3.2 TAIL-PCR 反应体系的设计
• 3.2.3.3 TAIL-PCR 反应条件的设计
• 3.3 结果
• 3.3.1 转座子 Tn5-1063a 右侧翼序列的获得
• 3.3.2 转座子 Tn5-1063a 左侧翼序列的获得
• 3.3.3 cysI 序列的获得
• 3.3.4 cysI 序列分析
• 3.3.5 cysI 的功能验证
• 3.4 讨论
• 第四章 Pseudomonas pseudoalcaligenes B50 铁载体合成相关基因pyrD 的克隆及功能初步分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌株与质粒
• 4.2.2 培养基与培养液及试剂
• 4.2.3 方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 转座子 Tn5-1063a 右侧翼序列的获得
• 4.3.2 转座子 Tn5-1063a 左侧翼序列的获得
• 4.3.3 pyrD 序列的获得
• 4.3.4 pyrD 序列分析
• 4.3.5 pyrD 的功能验证
• 4.4 讨论
• 第五章 Pseudomonas pseudoalcaligenes B50 铁载体合成相关基因1elA 片段的克隆
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 菌株与质粒
• 5.2.2 培养基与培养液及试剂
• 5.2.3 方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 转座子 Tn5-1063a 右侧翼序列的获得
• 5.3.2 转座子 Tn5-1063a 左侧翼序列的获得
• 5.3.3 relA 部分序列的获得
• 5.4 讨论
• 第六章 结论及建议
• 6.1 结论
• 6.2 尚待完成的工作
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文