hrpZ基因在大肠杆菌中的高效表达及生物活性检测

论文摘要

hrpZ是一种来源于植物病原菌丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的蛋白激发因子,它能引起非寄主植物的过敏性反应（hypersensitive response, HR）,表现为受侵染组织的快速、局部的萎缩和死亡,这就限制了病原菌进一步扩散的可能性。HR反应后,植物体内出现了一系列的防卫反应,如强化结构屏障作用,合成裂解酶或者产生植物抗毒素,具体表现在能够防止病菌二次或继发性侵染。这种非局部化、长期的诱导保护作用,其抗菌谱很广,极类似于“系统获得性抗性”（systematic acquired resistance,SAR）。 本文根据目的片段及表达载体设计引物,PCR扩增hrpZ基因片段,并克隆到pGEM-T载体中,经EcoRⅠ/XhoⅠ酶切、连接将hrpZ基因插入大肠杆菌表达载体pET32b（+）硫氧还蛋白下游,构建重组表达质粒pET-hrpZ,再将其转化至E.coliBL21（DE3）中,经筛选得到阳性克隆子,IPTG诱导表达HrpZ蛋白。SDS-PAGE显示,目的蛋白在重组菌株中得到了可溶性高效表达。该重组蛋白分子量为55.8KD,与理论值大小相符。采用叶片穿刺法,融合蛋白具有诱导烟草过敏反应的生物功能。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 前言
• 1.植物过敏反应（hypersensitive response，HR）
• 1.1 电解质流失
• 1.2 磷脂酶活性
• 1.3 钙流动
• 1.4 蛋白质磷酸化
• 1.5 脂氧合酶活性
• 1.6 活性氧产生
• 1.7 防卫基因活化
• 2.hrp基因
• 2.1 hrp基因的遗传组成
• 2.2 基因结构与同源性分析
• 2.3 hrp基因的表达和调控
• 2.4 hrp基因产物及其功能
• 2.4.1 基因调控功能
• 2.4.2 蛋白质转位泌出功能
• 2.4.3 hrp基因与avr基因的关系
• 2.4.4 编码HR反应激发子
• 3.Harpin蛋白
• 3.1 Harpin蛋白的结构与特点
• 3.2 Harpin蛋白作用机理
• 3.3 Harpin蛋白的应用
• 4.展望
• 5.本研究的背景、目的与意义
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 常用工具酶及试剂盒
• 1.3 引物
• 1.4 培养基
• 1.5 常用溶液
• 1.5.1 小量碱法制备质粒所用溶液
• 1.5.2 琼脂糖凝胶电泳所用溶液
• 1.5.3 丙烯酰胺凝胶电泳所用溶液
• 1.5.4 其它溶液的配制
• 1.6 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 克隆载体T-hrpZ的构建
• 2.1.1 含hrpZ基因质粒的提取
• 2.1.2 PCR
• 2.1.2.1 hrpZ基因片段的PCR扩增
• 2.1.2.2 PCR产物的回收与纯化
• 2.1.3 连接
• 2.1.4 转化
• 2.1.4.1 冷氯化钙法制备感受态细胞
• 2.1.4.2 质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞
• 2.1.5 阳性重组子的检测
• 2.1.5.1 菌落PCR鉴定
• 2.1.5.2 pGEM-T-hrpZ质粒的双酶切鉴定
• 2.1.5.3 hrpZ序列测定
• 2.2 原核表达工程菌BL21 （DE3） -pET-hrpZ的构建
• 2.2.1 用Xho I和EcoR I双酶切pGEM-T-hrpZ质粒和表达载体pET32（b）+
• 2.2.2 连接反应
• 2.2.3 含重组pET-hrpZ质粒的阳性菌落的筛选与鉴定
• 2.2.4 重组表达载体pET-hrpZ的构建
• 2.3 外源蛋白在E.coli BL21（DE3）中的表达
• 2.3.1 E.coli BL21（DE3）-pET-hrpZ的诱导表达
• 2.3.2 基因工程蛋白的粗提取
• 2.3.3 表达产物的SDS-PAGE鉴定
• 2.3.4 诱导条件优化
• 2.4 表达产物生物活性测定
• 2.4.1 样品处理
• 2.4.2 生物测定
• 实验结果
• 1 PCR扩增hrpZ基因
• 2 hrpZ基因的阳性克隆子的PCR与酶切鉴定
• 3 hrpZ基因的重组质粒鉴定
• 4 外源蛋白在E.coli BL21（DE3）中的表达
• 5 HrpZ蛋白诱导植物过敏反应活性检测
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 硕士期间发表和待发表的文章
• 致谢