微囊藻伪空胞基因丛的研究

论文摘要

微囊藻（Microcystis sp.）是广泛分布于世界各地的单细胞蓝藻,多生长于湖泊和池塘中,在夏季易大量生长而形成水华,造成水环境恶化。在微囊藻细胞中,有一种特殊的由中空圆柱状气囊组成的结构——伪空胞能够为细胞提供浮力,使它们在水体中垂直迁移,获得适宜的生长条件,因而,对于微囊藻水华的暴发起到重要的作用。本研究比较了多个微囊藻株的伪空胞基因丛结构特点,探讨了它们的系统演化关系和表达差异,并对一种微囊藻中伪空胞基因丛的转录调控进行了初步研究。主要研究内容和研究结果分为四个部分:第一,微囊藻FACHB854伪空胞基因丛的获得。首先构建FACHB854的基因组文库,筛选得到了含有gvpA-gvpC基因的克隆;利用PCR、反向PCR和测序,最终获得包含10个不同的基因、约7.5 kb的基因丛全长序列,其中gvpA有两个拷贝;用Southern blot杂交的方法证明,在FACHB854的基因组中仅存在这一个伪空胞基因丛。第二,微囊藻伪空胞基因丛的结构类型、演化关系和表达差异。对多种微囊藻的gvpA-gvpC区域进行了克隆测序,总结出伪空胞基因丛的四种结构类型:2gvpA+gvpC（3）、2gvpA+gvpC（4）、3gvpA+gvpC（4）和4gvpA+gvpC（3）;以微囊藻的rbcLX区域序列构建系统进化树,同时用各微囊藻株的gvpA-gvpC和gvpA-gvpA间隔区域序列、gvpC基因序列构建进化树分析伪空胞基因丛的进化过程,分析发现伪空胞基因丛的演化过程与微囊藻的系统进化基本同步;电镜观察不同微囊藻气囊的形态,进一步证明GvpC蛋白内部重复单位越多,微囊藻气囊的直径越大,而gvpA基因的拷贝数与气囊的直径无关。第三,gvp基因转录调控的初步研究。以微囊藻FACHB930为材料,在实验室条件下考察了不同温度、光照强度、氮源、碳源以及pH值条件下藻细胞的漂浮情况,认为该藻株的漂浮情况与培养物的初始pH值有关;用模板梯度稀释RT-PCR证实,在不同初始pH条件下,三个gvpA拷贝和gvpC基因的转录水平存在差异;用实时荧光定量PCR的方法,进一步证实微囊藻FACHB930中三个gvpA拷贝与gvpC基因的转录调节是相互协调的。第四,在研究中发现了一个可转座的微型插入因子。在微囊藻FACHB854的伪空胞基因丛中发现一个具有正向靶点重复和末端反向重复但不含有转座酶的微型插入因子ISM854-1;Southern blot杂交发现这一微型插入因子及其同源物在微囊藻FACHB 854的基因组中至少存在10个拷贝,而在其他的微囊藻株中没有或极少;用反向PCR的方法获得ISM854-1更多拷贝的序列,并确定其靶位点为8-bp的AT丰富区; ISM854-1的变异体ISM854-1A可能形成复合转座元件进行转座。本研究得到以下主要结论:（1）微囊藻的伪空胞基因丛可分为四种基本结构类型:2gvpA+gvpC（3）、2gvpA+gvpC（4）、3gvpA+gvpC（4）和4gvpA+gvpC（3）。其中,gvpA前的数字表示其拷贝数,gvpC后面括号里的数字表示GvpC蛋白中由33个氨基酸残基组成的保守重复单位的数量。（2）微囊藻FACHB930的三个gvpA拷贝和gvpC基因的转录水平是相互协调的。（3）蓝藻中存在非自主转座的微型插入因子。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 蓝藻水华与浮力
• 2 气囊的特征
• 2.1 伪空胞和气囊
• 2.2 气囊的分离纯化
• 2.3 气囊的形态和特征
• 2.4 气囊的化学组成
• 3 气囊的分子生物学研究
• 3.1 GvpA蛋白及其基因
• 3.2 GvpC蛋白及其基因
• 3.3 伪空胞基因丛
• 4 本研究的目的和总体设计
• 第二章 微囊藻FACH8854的伪空胞基因丛
• 1 材料和方法
• 1.1 藻株和培养条件
• 1.2 微囊藻FACH8854总DNA的提取
• 1.3 微囊藻FACH8854基因组文库的构建和目的克隆的筛选
• 1.4 PCR和反向PCR
• 1.5 Southern blot杂交
• 1.5.1 探针的标记
• 1.5.2 转膜和杂交
• 2 结果
• 2.1 构建微囊藻FACHB854的基因组文库
• 2.2 文库中筛选到含有gvp基因的克隆
• 2.3 微囊藻FACHB854中伪空胞基因丛全长的获得
• 2.4 Southern blot证明基因组中只有这一个伪空胞基因丛
• 3 讨论
• 第三章 微囊藻伪空胞基因丛的结构类型、系统演化和表达差异
• 1 材料和方法
• 1.1 蓝藻藻株和培养条件
• 1.2 微囊藻总DNA的提取
• 1.3 PCR反应及引物
• 1.4 进化树的构建
• 1.5 表达质粒的构建
• 1.6 原核表达和蛋白纯化
• 1.7 微囊藻气囊的分离和纯化
• 1.8 抗血清的制备
• 1.9 蓝藻总蛋白的提取和定量
• 1.10 SDS-PAGE
• 1.11 Western blot
• 1.12 负染色电镜观察
• 2 结果
• 2.1 伪空胞基因丛存在着四种基本结构类型
• 2.2 演化关系分析
• 2.3 基因丛类型与伪空胞蛋白表达水平
• 2.4 基因丛类型与气囊形态的关系
• 3 讨论
• 第四章 gvp基因表达调控的初步研究
• 1 材料和方法
• 1.1 藻株和培养条件
• 1.2 代时和生长速率
• 1.3 叶绿素a含量测定
• 1.4 总RNA的提取
• 1.5 模板梯度稀释RT-PCR
• 1.6 实时定量RT-PCR
• 1.6.1 标准品质粒DNA的制备
• 1.6.2 实时定量PCR反应
• 1.6.3 标准曲线的制作
• 1.6.4 测定不同培养条件下基因转录水平的差别
• 2 结果
• 2.1 环境因子与漂浮性
• 2.2 pH对gvpA和gvpC基因转录的影响
• 2.2.1 总RNA的检测
• 2.2.2 模板梯度稀释RT-PCR
• 2.2.3 实时定量RT-PCR
• 3 讨论
• 第五章 微囊藻FACH8854中微型插入因子的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 蓝藻藻株和培养条件
• 1.2 PCR、反向PCR
• 1.3 基因组文库的构建和目的克隆的筛选
• 1.4 Southern blot杂交
• 1.5 NCBI GenBank录入编号
• 2 结果
• 2.1 微型插入因子的发现和序列分析
• 2.2 ISM854-1及其同源序列在其他微囊藻株中的分布
• 2.3 ISM854-1的靶位点特征
• 2.4 ISM854-1的变异体
• 3 讨论
• 参考文献
• 本研究的创新点
• 攻读博士学位期间发表论文情况
• 附件1
• 附件2
• 致谢