酵母双杂交系统筛选IEX-1相互作用蛋白的研究

论文摘要

[目的]通过酵母双杂交技术筛选成人肝cDNA文库,寻找IEX-1相互作用蛋白,为进一步深入功能机制研究奠定基础。[材料与方法]应用酵母双杂交技术,通过筛选成人肝cDNA文库,寻找IEX-1相互作用蛋白。用Trizol方法提取骨肉瘤MG-63细胞RNA, RT-PCR扩增IEX-1基因编码区,电泳回收Spel/NotI双酶切连入pDBLeu载体,构建表达质粒。进一步进行,诱饵蛋白的自激活检测,文库筛选和回转验证等实验获得真阳性克隆。提取真阳性的克隆中cDNA融合质粒,测序,进一步生物信息分析。[结果]1.在融合蛋白表达质粒的构建过程中,我们成功获得IEX-1基因编码区片段并构建出融合蛋白表达质粒pDBLeu-IEX-1,经过酶切鉴定后测序证实各诱饵载体均切出了正常长度的插入片段和载体骨架片段。2.将重组成功的pDBLeu-IEX-1和空载体pDBLeu转化入酵母菌AH109进行毒性及自激活检测,结果发现pDBLeu- IEX-1对酵母菌AH109无毒性作用及自激活作用。3.使用诱饵质粒pDBLeu-IEX-1转化感受态细胞,30℃培养3～8 d后,将菌液涂布于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上初步筛选阳性克隆,初筛的阳性克隆进行X-α-gal显色进一步确认,结果共筛选出12个阳性克隆。4.提取12个克隆中cDNA融合质粒,与pDBLeu-IEX-1共转化入酵母菌株AH109回转验证,结果表明其中4个克隆为真阳性克隆,其他为假阳性克隆。将这4个真阳性克隆扩大培养、提质粒后测序,查出该cDNA融合质粒对应的基因,最终确定四个IEX-1相互作用的蛋白：C reactive protein （CRP）、Clusterin （CLU）、Cathepsin B （CTSB）、Heat shock protein 105 （HSPH1）。[结论]：1.成功构建酵母双杂交系统,经检验能够进行进一步的IEX-1相互作用的蛋白的筛选；2.通过酵母双杂交系统筛选出四个IEX-1相互作用的蛋白：Creactive protein （CRP）、Clusterin （CLU）、Cathepsin B （CTSB）、Heat shock protein 105 （HSPH1）。为进一步深入骨肉瘤发病机制研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 第一章 前言
• 第二章 材料和方法
• 1.材料
• 2.主要仪器及试剂
• 3.实验方法
• 4.结果观察及记录
• 第三章 结果
• 1.融合蛋白表达质粒的构建
• 2.诱饵质粒在酵母稳定株中毒性及自激活的检测
• 3.酵母双杂交筛选蛋白互作的阳性克隆
• 4.回转验证阳性相互作用
• 第四章 讨论
• 1.C—反应蛋白
• 2.溶酶体半胱氨酸蛋白酶B
• 3.Heat shock protein 105（HSPH1）
• 4.Clusterin（CLU）
• 第五章 结论
• 参考文献
• 综述 骨肉瘤细胞分子遗传学研究进展
• 致谢
• 读研期间发表的论文及研究成果