盐胁迫下酿酒酵母生理生化特性的研究

论文摘要

酵母是一种理想的真核模式生物，为广泛用于工业生产的生物材料。细胞在其自然栖息环境中和工业培养过程中，常常要忍受高盐、高糖渗透胁迫。为了揭示盐胁迫对酵母的作用，本文以酿酒酵母2144为出发菌，氯化钠作为渗透调节剂。研究了盐胁迫对酵母细胞生长、形态结构和代谢的影响，希望对相关工业生产提供理论依据。1．酵母细胞经NaCl处理后，菌落生长明显受抑制，细胞的活细胞数和生长密度均显著降低；在0.3mol/L NaCl作用下，细胞到达稳定期的时间与对照基本一致；而在0.6mol/L和1.0mol/L NaCl作用下，细胞生长缓慢，对数期延长；随着NaCl浓度的依次升高，细胞收缩，菌落数依次递减；葡萄糖消耗速率减慢；发酵结束后pH值降低。2.分析了NaCl胁迫下酵母胞内蛋白质的变化规律。在各种浓度的NaCl胁迫下酵母细胞均出现了相对分子质量为53kDa的蛋白质，随着NaCl浓度的升高该蛋白延迟表达。在添加0.3mol/L NaCl和0.6mol/L NaCl胁迫下，培养到10h时均出现两条蛋白谱带其分子量依次为61kDa和65kDa。3.分析了酵母细胞对Na+的吸收特征。随着NaCl浓度的依次升高，胞内Na+呈升高趋势而K+的含量呈下降趋势；Na+/K+比升高且在胁迫条件下的Na+/K+明显高于对照组。4.研究并发现海藻糖、甘油与酵母耐NaCl机制有关。酵母菌株在NaCl胁迫下胞内海藻糖含量明显高于对照组。随着NaCl浓度的增加，胞内甘油含量有着明显的增加。在不同盐胁迫浓度下，酵母胞外甘油的含量均随着胁迫时间的延长，呈现出先上升后下降的变化趋势。5.经Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析分离盐胁迫下酵母分泌蛋白可得出：当酵母细胞培养至8h时，无论是对照组还是胁迫组均在30管附近出现峰值管；胁迫组均在40管附近又出现峰值，而对照组则未出现。当酵母细胞培养至16h时，各组均在28管、42管附近出现峰值管；对照组和添加0.3mol/L NaCl的胁迫组均在11管出现峰值，而在添加0.6mol/L NaCl和1.0mol/L NaCl的胁迫组未出现；添加0.3mol/LNaCl的胁迫组在57管出现峰值管而对照组和其它两个浓度的胁迫组均未出现。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 渗透应激对酿酒酵母的影响
• 1.1.1 渗透作用
• 1.1.2 环境渗透压对酿酒酵母生存的影响
• 1.2 酿酒酵母对渗透胁迫的感应机制
• 1.2.1 酿酒酵母对高渗胁迫的感应机制
• 1.2.2 酿酒酵母对低渗胁迫的感应机制
• 1.3 酵母的盐胁迫应答的信号传导途径
• 1.3.1 高渗透性甘油促分裂原活化蛋白激酶途径
• 2+/CaM 的钙调磷酸酶'>1.3.2 依赖于 Ca²⁺/CaM 的钙调磷酸酶
• 1.3.3 环腺-磷蛋白激酶 A 途径
• 1.3.4 雷帕酶素靶分子信号途径
• 1.4 盐胁迫应答分子机制
• 1.4.1 离子平衡机制
• +平衡'>1.4.2 Na⁺平衡
• 2+平衡'>1.4.3 Ca²⁺平衡
• 1.5 酵母抗渗透应激的可能机理
• 1.5.1 主要渗透保护性物质的合成
• 1.5.1.1 甘油
• 1.5.1.2 海藻糖
• 1.5.2 影响抗渗透应激的因素
• 1.5.2.1 细胞周期与兼容溶质
• 1.5.2.2 液泡
• 1.6 微生物胁迫蛋白研究进展
• 1.6.1 胁迫条件下的微生物蛋白质组学
• 1.6.2 全局调控网络
• 1.6.3 盐胁迫反应的蛋白质研究
• 1.7 本研究的目的、意义及主要内容
• 第二章 盐胁迫下酿酒酵母生理特性的变化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.2 实验仪器
• 2.3 实验药品
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 盐胁迫下酵母菌株的生长量测定
• 2.4.2 盐胁迫下酵母细胞菌落生长情况观察
• 2.4.3 盐胁迫下酵母细胞存活力的测定
• 2.4.4 盐胁迫下酵母葡萄糖含量的测定
• 2.4.4.1 二硝基水杨酸的配制
• 2.4.4.2 葡萄糖标准曲线的绘制
• 2.4.4.3 葡萄糖含量的测定
• 2.4.5 盐胁迫下发酵 pH 值的测定
• 2.4.6 盐胁迫下酵母胞内蛋白浓度测定
• 2.4.6.1 Bradford 标准曲线的绘制
• 2.4.6.2 蛋白样品的制备及其含量测定
• 2.4.7 盐胁迫下酵母胞内蛋白分子量的测定
• 2.4.7.1 SDS-PAGE 电泳技术
• 2.4.7.2 蛋白质分子量计算方法
• 2.5 结果与讨论
• 2.5.1 盐胁迫下酵母菌株的生长量测定
• 2.5.2 盐胁迫下酵母细胞菌落生长情况观察
• 2.5.3 盐胁迫下酵母细胞存活力的测定
• 2.5.4 盐胁迫下酵母葡萄糖含量的测定
• 2.5.5 盐胁迫下发酵 pH 值的测定
• 2.5.6 盐胁迫下酵母胞内蛋白浓度测定
• 2.5.7 盐胁迫下酵母胞内蛋白的 SDS-PAGE 图谱
• 2.6 小结
• 第三章 盐胁迫下酿酒酵母的渗透调节机制
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.2 实验仪器
• 3.3 实验药品
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 酿酒酵母培养
• +、K⁺离子浓度测定'>3.4.2 盐胁迫下酵母胞内 Na⁺、K⁺离子浓度测定
• 3.4.2.1 测定条件
• +、K⁺标准曲线的绘制'>3.4.2.2 Na⁺、K⁺标准曲线的绘制
• +、K⁺离子提取测定'>3.4.2.3 胞内 Na⁺、K⁺离子提取测定
• 3.4.3 盐胁迫下酵母胞内海藻糖含量测定
• 3.4.3.1 海藻糖标准曲线的绘制
• 3.4.3.2 胞内海藻糖的提取和测定
• 3.4.4 盐胁迫下酵母胞内、胞外甘油含量的测定
• 3.4.4.1 甘油标准曲线的绘制
• 3.4.4.2 酵母菌中甘油的提取测定
• 3.5 结果与讨论
• +、K⁺离子浓度动态变化规律'>3.5.1 盐胁迫下酵母胞内 Na⁺、K⁺离子浓度动态变化规律
• +的动态变化规律'>3.5.1.1 胞内 Na⁺的动态变化规律
• +的动态变化规律'>3.5.1.2 胞内 K⁺的动态变化规律
• +/K⁺比的动态变化规律'>3.5.1.3 胞内 Na⁺/K⁺比的动态变化规律
• 3.5.2 盐胁迫下酵母胞内海藻糖的动态变化规律
• 3.5.3 盐胁迫下酵母菌中甘油的动态变化规律
• 3.5.3.1 胞内甘油的动态变化规律
• 3.5.3.2 胞外甘油的动态变化规律
• 3.6 小结
• 第四章 盐胁迫下酿酒酵母分泌蛋白的提取分离
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.2 实验仪器
• 4.3 实验药品
• 4.4 实验方法
• 4.4.1 酿酒酵母培养
• 4.4.2 酵母菌株在盐胁迫下的生长量测定
• 4.4.3 酵母分泌蛋白的制备
• 4.4.4 样品的凝胶层析分离
• 4.4.4.1 凝胶溶胀
• 4.4.4.2 装柱和平衡
• 4.4.4.3 色谱床校正
• 4.4.4.4 加样
• 4.4.4.5 洗脱与收集
• 4.5 结果与讨论
• 4.5.1 不同浓度 NaCl 胁迫下酿酒酵母的生长曲线
• 4.5.2 凝胶过滤层析技术分离酵母分泌蛋白
• 4.5.2.1 Sephadex G-25 分离 YNB 对照组的分泌蛋白图谱
• 4.5.2.2 Sephadex G-25 分离 YNB 添加 0.3 mol/L NaCl 组的分泌蛋白图谱
• 4.5.2.3 Sephadex G-25 分离 YNB 添加 0.6 mol/L NaCl 组的分泌蛋白图谱
• 4.5.2.4 Sephadex G-25 分离 YNB 添加 1.0 mol/L NaCl 组的分泌蛋白图谱
• 4.6 小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录 A
• 附录 B