RNA干扰铁蛋白轻链的表达对RAW264.7细胞炎症反应影响及其机制的研究

论文摘要

铁蛋白（ferritin）作为动植物细胞内的储铁蛋白,在维持铁代谢稳定平衡中发挥着重要的作用。近些年来,人们对于它的其他功能也有了越来越多的认识,铁蛋白亚基之一的铁蛋白轻链（ferritin light chain, FTL）除了在铁代谢过程中发挥储铁功能外,还很可能参与了炎症的发生。致炎因子刺激巨噬细胞可以产生多种炎症介质,包括活性氧物质（reactive oxidative species, ROS）,前炎症因子如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1 beta, IL-1β）,诱导型一氧化氮合酶（inductible nitric oxide synthase, iNOS）、环氧合酶-2 （cyclooxygenase-2, COX-2）,细胞毒素如一氧化氮（nitric oxide, NO）、前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）等。炎症介质的大量产生可导致各种严重的炎性疾病的发生。如风湿性关节炎、脓毒症、心血管病、帕金森及肿瘤等。炎症介质需要通过信号通路的参与调控其产生及释放。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）和核因子-κB （nuclear factor-kappa B, NF-κB）是参与调控炎症介质的产生及释放的主要信号途径。在炎性疾病的发生过程中起到重要的调控作用。本课题研究了干扰FTL表达对炎症发生的作用。我们首先构建了针对FTL的短发夹RNA（shRNA）干扰载体即FTL-shRNA干扰载体,并转染入RAW264.7细胞,筛选出稳定表达FTL-shRNA的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7作为实验模型,转染空载pRNA-U6.1质粒的RAW264.7作为实验对照。用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）（?）乍为炎症诱导剂,运用Western Blot、RT-PCR、和ELISA等方法技术研究了干扰FTL表达对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应（即各种炎症介质的产生和释放）的影响以及分子机制。结果发现shRNA干扰FTL的表达增加了LPS诱导的RAW264.7细胞中前炎症因子TNF-a和IL-1β的mRNA水平和释放到细胞外的TNF-α、IL-1β的量；提高了LPS诱导的iNOS和COX-2的mRNA（?）口蛋白水平的增加,提高了LPS诱导的分泌至胞外的NO和PGE2的量。这些结果说明FTL参与了炎症反应并在其中发挥了重要的调节作用。MAPK和NF-κB信号通路在炎症反应中发挥重要作用,它们受致炎因子的激活,调控多种炎症介质的产生和表达。为了进一步阐明FTL的调节机制,我们研究了干扰FTL表达对LPS诱导的MAPK和NF-κB信号通路激活的影响。结果显示,干扰FTL表达能增强LPS诱导的MAPK家族中的ERK和JNK的磷酸化激活,并可通过增强LPS诱导的IKB磷酸化及其降解增强NF-κB信号通路的激活。说明FTL通过抑制LPS诱导的MAPK和NF-κB信号通路的激活从而抑制炎症介质的产生和释放,进而减弱LPS诱导的巨噬细胞炎症反应。本论文结果对于进一步深入研究FTL对炎症反应的调控,了解并掌握FTL在人体中的新功能有非常重要的意义,并为研究FTL在炎性疾病治疗中的作用提供新思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 文献综述
• 一、铁蛋白轻链研究进展
• 1 铁在人体的主要功能
• 2 FTL的分子结构及其主要功能
• 3 FTL参与炎症反应
• 二 MAPK和NF-κB信号转导通路研究进展
• 1 MAPK和NF-κB信号转导通路
• 2 MAPK和NF-κB信号转导通路调控炎症反应
• 三 RNA干扰技术及应用
• 引言
• 第一部分 FTL-shRNA表达载体的构建与稳定表达细胞株的筛选
• 1 材料与试剂
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要实验试剂
• 2 实验方法
• 2.1 短发夹式小干扰RNA（shRNA）的设计与构建
• 2.2 细胞培养
• 2.3 FTL-shRNA稳定表达细胞株筛选
• 2.4 Western Blot检测蛋白表达
• 3 结果
• 3.1 瞬时转染后四对FTL-shRNA的干扰效果
• 3.2 稳定表达FTL-shRNA细胞株的鉴定
• 4 讨论
• 5 小结
• 第二部分 干扰FTL的表达对LPS诱导RAW264.7细胞炎症反应的影响
• 1 材料与试剂
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要实验试剂
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养及处理
• 2.2 RT-PCR检测mRNA表达
• 2.3 ELISA检测TNF-α和IL-1β蛋白释放量（按试剂盒说明操作）
• 2.4 Western Blot检测蛋白表达
• 2.5 酶法检测NO释放量（按试剂盒说明操作）
• 2.6 ELISA检测PGE2蛋白释放量（按试剂盒说明操作）
• 2.7 数据统计分析
• 3 结果
• 3.1 干扰FTL表达对LPS诱导的TNF-α和IL-1β mRNA水平的影响
• 3.2 干扰FTL表达对LPS诱导的TNF-α和IL-1β释放量的影响
• 3.3 干扰FTL表达对LPS诱导的iNOS和COX2 mRNA水平的影响
• 3.4 干扰FTL表达对LPS诱导的iNOS和COX-2蛋白水平的影响
• 3.5 干扰FTL表达对LPS诱导的NO和PGE2释放量的影响
• 4 讨论
• 5 小结
• 第三部分 干扰FTL表达影响LPS诱导RAW264.7炎症反应的机制
• 1 材料与试剂
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要实验试剂
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养及处理
• 2.2 Western Blot检测蛋白表达
• 2.3 数据统计分析
• 3 结果
• 3.1 干扰FTL表达对LPS诱导的ERK、JNK信号通路的影响
• 3.2 干扰FTL表达对LPS诱导激活的NF-κB信号通路的影响
• 4 讨论
• 5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历
• 攻读学位期间取得的科研成果清单