Aβ1-42寡聚体特异性scFv的筛选、鉴定和亲和力成熟的初步研究

论文摘要

老年性痴呆（Alzheimer’s disease,AD）是一种渐进性神经退行性疾病,其病理特征是渐进性的老年斑沉积,神经突触丢失和神经纤维缠结,临床表现为记忆功能衰减及识别能力障碍,同时伴有各种神经症状和行为障碍。在老年人群,具有非常高的发病率,目前还没有特异性治疗药物。近年来AD的发病机理和药物研究方面都有突破性进展,尤其是制备针对β淀粉样蛋白（amyloid beta protein,Aβ）特异性抗体药物成为AD治疗极具价值的途径。噬菌体展示技术（phage display）为抗体制备开创了一条简便、快速的基因工程抗体制备方法。噬菌体抗体是在噬菌体表面表达抗体分子的抗原结合片段（Antigen binding fragment,Fab）或单链抗体（single chain fragment variable, scFv）,单链抗体具有分子量小,免疫原性低,穿透力强,定位迅速,易于基因工程制备和改造等优点。通过构建和筛选人源性天然噬菌体抗体库,得到Aβ寡聚体特异性人源性单链抗体,可直接应用于人AD的治疗。利用噬菌体展示技术构建人源性天然抗体库,以可溶性Aβ1-42寡聚体对抗体库进行筛选获得针对低分子量Aβ1-42寡聚体的特异性单链抗体。分离10个健康人外周血淋巴细胞,提取总RNA,RT-PCR法得到cDNA链,以cDNA链为模板扩增得到全套人抗体VH和VL基因,经过重叠延伸PCR将VH和VL连接得到scFv片段,将scFv片段酶切后克隆至pCANTAB5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,经辅助噬菌体M13K07拯救,获得库容为2.5×109单链抗体库。以可溶性Aβ1-42寡聚体为抗原,对抗体库进行四轮筛选,ELISA法筛选特异性识别Aβ1-42寡聚体的阳性克隆,将筛选到的阳性克隆B19转化至E.coli HB2151,诱导表达可溶性scFv。SDS-PAGE及Western Blot分析结果显示可溶性scFv获得了正确表达,且能够与Aβ1-42三聚体及纤维特异性结合,可溶性scFv与Aβ1-42寡聚体的亲和常数为9×10-6 mol/L。将单链抗体的重链和轻链可变区基因克隆入原核表达载体pComb3C/cFab中,转化TOP10感受态,诱导表达了重组抗体B19-Fab。SDS-PAGE及Western Blot分析结果显示,重组抗体B19-Fab得到了正确的表达。ELISA结果显示,重组抗体B19-Fab仍然保持对Aβ1-42寡聚体特异性结合活性。对单链抗体亲和力成熟进行的初步研究为后续的打下了良好的基础。本实验中获得的Aβ1-42寡聚体特异性单链抗体为老年性痴呆症（AD）的临床治疗研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 老年性痴呆抗体研究的意义和必要性
• 1.1.1 AD 发病机理
• 1.1.2 抗体作用机制
• 1.2 AD 免疫治疗的国内外研究现状和发展趋势
• 1.2.1 主动免疫治疗
• 1.2.2 被动免疫治疗
• 1.2.3 AD 免疫治疗发展趋势
• 1.3 噬菌体展示技术研究现状和发展趋势
• 1.3.1 噬菌体抗体库的基本原理
• 1.3.2 现有的噬菌体抗体库
• 1.3.3 抗体库技术的发展趋势
• 1.4 研究目的和内容
• 1.4.1 研究目的
• 1.4.2 研究内容
• 2 实验一人源性天然噬菌体抗体库构建、鉴定及 Aβ1-42寡聚体特异性单链抗体的筛选
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 PCR 引物
• 2.1.3 培养基与溶液
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 Aβ1-42寡聚体的制备
• 2.2.2 人源性噬菌体抗体库的构建
• 2.2.3 噬菌体抗体库的富集和筛选
• 2.2.4 Phage ELISA 鉴定阳性克隆
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 外周血淋巴细胞总 RNA 的提取和鉴定结果
• 2.3.2 全套 VH 和 VL 基因的扩增及scFv 基因的拼接和扩增
• 2.3.3 噬菌体抗体库的鉴定
• 2.3.4 Aβ1-42 寡聚体特异性噬菌体抗体库的富集
• 2.3.5 重组噬菌体单链抗体 ELISA 鉴定
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3 实验二 scFv 在大肠杆菌中的表达及功能鉴定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 缓冲液和培养基
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 B19 单链抗体质粒提取、鉴定和序列分析
• 3.2.2 B19 单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达及鉴定
• 3.2.3 表达产物的纯化
• 1-42寡聚体的特异性识别'>3.2.4 可溶性scFv 对 Aβ_1-42寡聚体的特异性识别
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 B19 序列分析
• 3.3.2 SDS-PAGE 分析 B19 在 E.coli H82151 中的表达
• 3.3.3 Western Blot 分析 B19 在 E.coli H82151 中的表达
• 3.3.4 可溶性scFv 对 Aβ1-42寡聚体的特异性识别
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 4 实验三 B19 抗体亲和力成熟的初步研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 PCR 引物设计
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 pCom63C/cFab 载体质粒的扩增及鉴定
• 4.2.2 B19 重链可变区和轻链可变区的扩增
• 4.2.3 B19-Fab 重组质粒的构建
• 4.2.4 B19-Fab 重组质粒的表达及鉴定
• 4.2.5 ELISA 检测 B19-Fab 重组抗体对 Aβ1-42寡聚体的特异性识别
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 pCom63C/cFab 载体质粒的扩增及鉴定
• 4.3.2 B19 抗体重链和轻链可变区的扩增
• 4.3.3 B19-Fab 重组质粒的检测
• 4.3.4 B19-Fab 重组质粒的表达和鉴定
• 4.3.5 B19-Fab 重组抗体对 Aβ1-42 寡聚体的特异性识别
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 5 论文总结
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介