低氧培养对人脐带间充质干细胞成软骨分化特性的影响

论文摘要

目的体外分离培养人脐带间充质干细胞并对其进行鉴定,探讨体外低氧培养环境对其成软骨分化能力的影响。方法采用酶消化法分离培养人脐带沃顿胶组织来源间充质干细胞,加入含10%FBS的DMEM/F12培养基中进行原代培养；待细胞生长至80-90%融合时,1：3传代培养。通过倒置显微镜观察细胞形态变化,采用MTT法检测细胞增殖能力,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原。取传3代细胞采用条件培养基诱导其向成软骨方向分化,根据培养氧浓度分为实验组（2%氧浓度）及对照组（20%氧浓度）。诱导2周后细胞爬片进行甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组化染色,应用RT-PCR技术检测HIF-1α、Sox-9及CoL2al mRNA表达,研究低氧环境对人脐带干细胞成软骨分化的影响。结果原代培养细胞贴壁生长,初始细胞形态呈短梭形、梭形或多角形；传代后细胞多呈均一的成纤维样细胞形态,细胞贴壁和增殖速度明显加快,呈平行排列生长或旋涡状生长；MTT法检测第3、5、7代脐带干细胞均具有较强的增殖能力；流式细胞仪检测传3代脐带干细胞95%表达CD29,96%表达CD44,仅有0.8%表达CD45、1.8%表达CD31,与间充质干细胞表面抗原表达一致；诱导2周后低氧培养组细胞甲苯胺兰染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色均显示强阳性反应,胞浆及胞膜异染明显,而对照组染色显示弱阳性反应；RT-PCR检测结果显示实验组HIF-1α、Sox-9及CoL2al mRNA表达均显著强于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论采用酶消化法可以成功分离培养人脐带间充质干细胞；低氧培养环境可促进人脐带间充质干细胞向成软骨方向分化,其机制可能与HIF-1α基因表达上调有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词简表
• 第一章 前言
• 第二章 材料和方法
• 2.1 主要试剂
• 2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 脐带来源
• 2.3.2 细胞分离、培养及纯化
• 2.3.3 传代培养
• 2.3.4 细胞生长曲线绘制
• 2.3.5 流式细胞仪检测脐带间充质干细胞表面抗原
• 2.3.6 脐带干细胞成软骨分化低氧培养诱导
• 2.3.7 甲苯胺蓝染色
• 2.3.8 Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色
• 2.3.9 RT-PCR检测成软骨分化特异性基因HIF-1α、Sox-9及Col-2a1表达
• 2.4 统计学处理
• 第三章 结果
• 3.1 脐带干细胞形态学观察
• 3.2 细胞生长曲线
• 3.3 细胞表面抗原测定
• 3.4 甲苯胺蓝染色
• 3.5 Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色
• 3.6 RT-PCR检测诱导2周HIF-1α、Sox-9及Col-2a1 mRNA表达情况
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间主要的研究成果