深海细菌草甘膦抗性基因的克隆、表达与分析

论文摘要

抗草甘膦微生物的筛选和抗性基因挖掘是抗除草剂研究的焦点之一。但对于从海洋微生物中筛选抗草甘膦基因的研究甚少。为了从海洋微生物中获得具有应用价值的抗草甘膦基因,本研究从深海微生物中筛选得到了两株具有良好抗草甘膦活性的细菌。分别对这两株细菌构建基因组文库,从中筛选获得了两个具有草甘膦抗性的基因,分别将这两个基因在大肠杆菌中表达并进行作用机理分析。主要研究结果如下：1、从深海中获得的编号为AJ415377和X74723的海洋细菌菌株在100mMol草甘膦培养基上生长良好；分别以总DNA为模板进行16S rDNA扩增,测序比对结果显示AJ415377与Brachybacterium paraconglomeratum的同源性最高,为97.973%,说明该菌株为副凝聚短状杆菌。X74723与Vibrio proteolyticus同源性最高,为99.588%,说明该菌株为解蛋白弧菌。2、以pUC18为载体分别构建海洋菌Brachybacterium paraconglomeratum与Vibrio proteolyticus的基因组文库,通过草甘膦培养基从Brachybacterium paraconglomeratum和Vibrio proteolyticus的基因组文库中筛选阳性克隆子,得到两个阳性克隆。序列分析表明来自Brachybacterium paraconglomeratum的克隆子Bp-nupCc包含一个不完整的ORF,但此ORF编码的氨基酸序列包含一个完整的功能域,全长为495bp, C+G含量为51.6%,编码165个氨基酸,与nucleoside permease NupC同源性为95%,属于GATE超级家族中的核苷通透酶,命名为NupCc。NupCc的氨基酸序列与肌氨酸氧化酶C链有25%的同源性,其同源区域在肌氨酸氧化酶的第一功能域和第二功能域均有分布。其作用机理有待进一步研究。序列分析表明：来自Vibrio proteolyticus的阳性克隆子Vp-Cglh包含两个完整的ORF,命名为ORF0和ORF1,ORF0全长为492bp, C+G含量为55.6%,编码163个氨基酸,命名为Cglh0; ORF1全长996bp, C+G含量为55.9%。在氨基酸水平与已知蛋白同源性均低于30%,是一个新的抗草甘膦基因,命名为Cglh。3、分别将基因NupCc、Cglh和Cglh0,插入大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1,转化大肠杆菌DL21（DE3）重组表达,发现GST-NupCC和GST-CglH0均为包涵体；GST-CglH经过亲和柱层析纯化,得到纯化蛋白CglH。4、滤纸显色实验显示,酶反应产物与水合茚三酮呈阳性反应。表明草甘膦分子中的亚胺基经CglH处理后发生了变化,由此推测CglH可直接作用于草甘膦。进而通过展层层析实验,发现酶作用后草甘膦的量明显减少,并伴随有新的物质形成。对酶反应产物进行液质联用分析,发现产物被去质子化时多了一个成分（这个成分的分子量为150）。根据草甘膦分子式分析,发现分子量为150的物质与脱去一分子水的草甘膦分子量相同.初步说明CglH作用于草甘膦的方式可能是脱水作用,但确认其作用机理尚需进一步研究。本研究为抗草甘膦基因的筛选提供了候选基因,也为深入研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1. 前言
• 1.1 杂草的危害
• 1.2 除草剂概述
• 1.2.1 除草剂的起源
• 1.2.2 除草剂的作用机理
• 1.2.3 除草剂的分类
• 1.2.4 近期除草剂的开发的特点
• 1.3 转基因抗除草剂农作物
• 1.4 草甘膦
• 1.4.1 草甘膦理化性质
• 1.4.2 草甘膦作用机理
• 1.4.3 生物抗草甘膦的三种策略
• 1.4.4 转基因抗草甘膦农作物
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 溶液
• 2.1.5 仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 具有草甘膦抗性的海洋细菌的筛选
• 2.2.2 海洋菌Brachybacterium paraconglomeratum和Vibrio proteolyticus基因组总DNA的提取
• 2.2.3 菌株种属特异性鉴定
• 2.2.4 抽提pUC18质粒
• 2.2.5 载体的酶解、脱磷
• 2.2.6 海洋菌基因组DNA不完全酶解
• 2.2.7 载体与不完全酶解的DNA片段酶连
• 2.2.8 感受态细胞E.coli DH5α的制备
• 2.2.9 转化
• 2.2.10 文库验证
• 2.2.11 阳性克隆的筛选
• 2.2.12 生物信息学分析插入片段
• 2.2.13 海洋菌Brachybacterium paraconglomeratum中核苷通透酶基因（NupCc）的研究
• 2.2.14 海洋菌Vibrio proteolyticus中基因Cglh和Cglh0的研究
• 3. 结果与分析
• 3.1 具有草甘膦抗性的海洋细菌的筛选
• 3.2 海洋菌BRACHYBACTERIUM PARACONGLOMERATUM和VIBRIO PROTEOLYTICUS基因组文库的建立
• 3.2.1 海洋菌Brachybacterium paraconglomeratum和Vibrio proteolyticus基因组DNA的抽提
• 3.2.2 菌株种属特异性鉴定
• 3.2.3 Puc18载体的制备
• 3.2.4 海洋菌Brachybacterium paraconglomeratum和Vibrio proteolyticus基因组DNA的部分酶解
• 3.2.5 对构建的基因组文库进行质量检测
• 3.2.6 文库中阳性克隆的筛选
• 3.2.7 用生物信息学对插入片段进行序列分析
• 3.3 核苷通透酶的相关研究
• 3.3.1 核苷通透酶基因的克隆
• 3.3.2 NupCc的表达
• 3.4 蛋白CGLH和CGLH0的相关研究
• 3.4.1 基因Cglh和Cglh0的克隆
• 3.4.2 CglH的表达与纯化
• 3.4.3 滤纸显色实验研究草甘膦脱水酶CglH的特性
• 3.4.4 薄层层析实验研究草甘膦脱水酶CglH的特性
• 3.4.5 液质联用实验研究草甘膦脱水酶CglH的特性
• 4. 讨论
• 参考文献
• 附录
• 1. 核苷通透酶核苷酸序列及氨基酸序列
• 2. 草甘膦脱水酶核苷酸及氨基酸序列
• 3. 核苷通透酶谱系报告
• 致谢