论文摘要
恶性肿瘤是继心血管疾病之后发病率和病死率很高的疾病，严重威胁着人类的健康。而结肠癌是近年来常见恶性肿瘤中增长率最大的疾病之一。目前使用的化疗药物存在诸如免疫抑制、骨髓抑制等严重损害患者免疫系统的毒副作用，很难改善患者的生存质量。近年来，中医药在抗肿瘤治疗方面研究的比较多，天然药物在抗肿瘤方面越来越发挥出其毒副作用小，来源方便的独特优势。在畅销的抗肿瘤植物药中，从红豆杉中提取的紫杉醇在肿瘤的治疗上起着举足轻重的作用。紫杉醇继治疗卵巢癌取得显著疗效之后，又被发现对于结肠癌也具有良好的治疗作用，但红豆杉中抗癌活性成分的研究多年来的研究走的一直是西药化的路线，制得的纯品价格昂贵，副作用大。紫杉醇多以注射剂为主要剂型，但红豆杉植物中还含有大量其他抗癌活性物质，由于不允许它们进入注射剂，在提取分离过程中只得将其作为杂质弃去，非常可惜和浪费。本实验以中医理论为指导，提取了云南红豆杉枝叶中抗癌有效组分，旨在克服只依靠紫杉醇单体为有效成分所造成的一系列问题，其中的其他紫杉烷类化合物及总黄酮，总木脂素，生物碱等都在一定程度上有抗肿瘤作用，与紫杉醇配伍后，可发挥中药的多成分多靶点的独特优势，通过多方面途径提高药物疗效，并且减低紫杉醇的毒副作用，红豆杉资源紧缺，其他组分同时配伍使用还可以最大限度地利用其所含的其他有效成分，节省资源，降低产品价格。研究表明，红豆杉属植物中含有的多种有益组分，对结肠癌细胞亦有协同的药理作用。红豆杉有效成分多难溶于水，口服后不易被吸收，采用固体分散体，可增加药物的溶出度；结肠的靶向制剂对于须经大肠给药治疗的疾病具有特殊的意义，制成直肠的靶向给药系统，可将药物直接送到结肠部位，达到治疗作用，提高生物利用度。目的：1．对国内外有关红豆杉以及红豆杉中主要有效成分紫杉醇和其他相关物质的研究文献资料进行分类综述；对有关结肠癌疾病的文献进行总结，对固体分散技术和结肠靶向技术的国内外研究情况进行综述，对目前红豆杉制剂的主要研究概况加以合理的分析。2．建立抗癌活性组分的含量测定方法。3．考察红豆杉的基源和用药部位，以及影响云南红豆杉枝叶质量的主要因素，以保证原料药材的质量，提高原料的利用率，为科学制定云南红豆杉质量标准提供可以参考的理论依据。4．依次对云南红豆杉枝叶进行提取工艺研究；初步除杂工艺研究；过柱精制工艺的研究，以改革传统的提取分离工艺，使其更加适合大生产，提高紫杉烷类化合物的转移率。5．研究红豆杉提取物对体外结肠癌细胞的抑制作用，制定提取物的质量标准。6．制备提取物的肠溶固体分散体，并进一步制成微丸。7．对肠溶微丸进行评价和质量标准的研究。方法：1．将计算机检索、手工追溯检索等手段相结合，充分利用CA、BP、MEDLARS、CBM-Disc、CNKI数字图书馆全文数据库、CMCC中文生物医学期刊文献数据库、互联网等数据库，广泛查阅有关红豆杉资源及研究进展，主要化学成分、结构与性质，提取分离方法，药理与临床，制剂与商品等资料；查阅结肠癌的发病概况、诊断要点、病因病机及治疗和预防；查阅结肠靶向制剂的生理学基础，结肠吸收及剂型分类。2．采用高效液相色谱法对云南红豆杉枝叶中紫杉烷类化合物进行含量测定，并进行方法学的考察。采用紫外分光光度法对总黄酮类成分进行含量测定，并进行方法学的考察。3．以紫杉烷类化合物含量为主要指标，采用固相萃取法精制样品，评价不同基源红豆杉的质量，云南红豆杉不同用药部位以及不同生长年限和贮藏时间对云南红豆杉枝叶质量的影响。4．以总萜得率，提取物中紫杉烷类化合物的含量，紫杉醇的转移率为指标，比较不同提取方法对云南红豆杉的提取效果。以除杂现象、除膏率、除杂前后紫杉烷类化合物的损失情况为指标，比较NaHCO3萃取法、石油醚脱脂、石灰乳沉淀法的脱脂除杂效果，并考察除杂后药液氯仿、乙酸乙酯萃取法，以及氯仿萃取物活性炭脱色的条件。分别考察了硅胶柱、大孔树脂柱和氧化铝柱的前处理工艺和柱层析条件。5．实验经预试筛选出敏感结肠癌细胞株SW480和HCT-8。药物分为五组，每组5个浓度进行试验。以MTT法研究红豆杉提取物对于结肠癌细胞的增长抑制作用。对提取物的质量标准做了研究。并制定了药材的含量测定限度。6．通过体外人工结肠液溶出实验，筛选不同处方的肠溶固体分散体；制得的固体分散体使用包衣锅法制备微丸，以圆整度、粒径分布、堆密度、碎脆度为考察指标，筛选稀释剂的种类、稀释剂用量和黏合剂的种类。7．采用体外人工胃液、肠液、结肠液溶出对微丸的体外溶出进行评价。对微丸的处方、制法、性状、水分、含量测定等做了研究。结果：1文献综述利用各种检索工具、数据库，使用关键词红豆杉or紫杉醇、提取or分离、结肠肿瘤、靶向，共查阅文献约90篇，国外多集中于红豆杉的化学成分研究，国内多集中于产地，含量测定，药理药效及临床应用研究。国内可见有用指纹图谱评定东北红豆杉的质量，见有对云南红豆杉进行提取和鉴定以及抗肿瘤实验的研究，见有体外紫杉醇免疫脂质体对人大肠癌细胞的靶向作用的实验，但未见有综合以上技术对红豆杉中主要抗癌组分开发利用并制出针对结肠癌的靶向制剂的研究报道。国外可见有为了提高红豆杉中紫杉醇等有效成分的提取的研究，见有为提高紫杉醇治疗的靶向性和提高效能的剂型研究报道。2活性组分的含量测定2．1含量测定样品的制备：使用固相萃取柱进行分离，收取不同组段的流出液，测定紫杉烷类化合物，回收率较高。2．2有效组分含量测定：采用高效液相法建立准确科学的测定云南红豆杉药材中三种紫杉烷类化合物的含量的方法，三者在0.04μg～3.0μg之间内均呈线性关系。采用紫外分光光度法建立了准确科学的测定总黄酮含量的方法，总黄酮线性范围为8～48μg／ml。3药材质量研究3．1红豆杉基源的研究经过比较，云南红豆杉的主要抗癌物质紫杉烷类成分含量较高，较其他种的红豆杉质量要好，可以作为本实验的原料药材。3．2红豆杉药用部位的研究考察了云南红豆杉的不同部位中紫杉烷类化合物的含量。虽然针叶中含量比树皮中少，但采集针叶和嫩枝不会损伤植物，还可以不断再生，且总量远远大于干皮，为保护资源，从云南红豆杉枝叶中获取紫杉烷类化合物具有重要的意义。3．3不同生长年限对云南红豆杉枝叶质量的影响随着生长年限的增加，云南红豆杉枝叶中紫杉类化合物的含量逐渐增加，因此枝叶的采摘以5年生以上为佳。3．4贮藏时间对云南红豆杉枝叶质量的影响随着贮藏时间的加长，红豆杉中紫杉烷类成分的含量有所降低，为保证红豆杉的质量，应以新鲜的枝叶为佳，贮藏时间不易超过半年。4提取物制备工艺研究4．1提取工艺研究用不同溶剂及提取方法进行提取时，以乙醇浸渍法最优，经正交实验筛选，最优醇提条件为85％乙醇浸提两次，第一次7倍量24小时，第二次5倍量12小时。超临界CO2萃取法先用纯CO2萃取，再加入夹带剂进行萃取，优于传统溶剂法对于红豆杉中有效成分的提取。4．2初步除杂工艺研究NaHCO3萃取法的乳化现象比较严重，且紫杉烷类化合物损失较大。石灰乳沉淀法能够去除大量的杂质，但是终点pH值很难控制，有效成分损失比较大；使用石油醚具有较好的脱脂效果。脱脂后的药液以氯仿萃取四次就可将有效成分充分萃取干净。氯仿萃取后的药液用0.25％（W／V）活性炭，在35℃下脱色。4．3精制工艺采用硅胶柱——大孔树脂柱——氧化铝柱进行串联分离精制红豆杉中的有效组分。即浸膏氯仿溶解，加于已处理好的硅胶柱上，氯仿冲洗至流出液无色，用氯仿—甲醇（97：3）洗脱，收集3倍生药量洗脱液减压回收溶剂成浸膏，浸膏用适量乙酸乙酯—丙酮（1：1）溶解，滤除不溶物，滤液用适量大孔树脂拌样，加于处理好的大孔树脂柱顶端，3倍柱体积30％乙醇洗脱，然后换用6倍柱体积85％乙醇洗脱。收集洗脱液减压回收乙醇，适量氯仿溶解，滤除不溶物，加于处理好的氧化铝柱顶端，氯仿洗至无色，换用7倍柱体积的氯仿—甲醇（97：3）洗脱，收集洗脱液，减压回收氯仿，继续减压浓缩（60℃，-0.08Mpa）至稠膏状，将稠膏减压干燥（60℃，-0.08Mpa），得红豆杉提取物。5红豆杉提取物对结肠癌细胞的抑制作用和质量标准的制定在选定的范围内，红豆杉提取物、紫杉醇、紫杉醇与三尖杉宁碱的混合物、紫杉醇与三尖杉宁碱与红豆杉素Ⅳ的混合物作用于结肠癌HCT—8和SW480细胞72h后，均表现出一定的细胞增长抑制作用。紫杉醇、紫杉醇与三尖杉宁碱的混合物、紫杉醇与三尖杉宁碱与红豆杉素Ⅳ的混合物的抑瘤作用逐渐增强。通过提取物质量标准的研究，规定按干燥品计算，提取物中含紫杉醇不得少于16％，含三尖杉宁碱和红豆杉素Ⅳ的总量不得少于35％。6固体分散体的制备方法以丙烯酸树脂L100—55做为肠溶载体材料，取过60目的红豆杉提取物一份用无水乙醇溶解，滤过，得1组，取丙烯酸树脂L100—55树脂二份，用无水乙醇溶解，得2组，在搅拌下将1组加入2组份中，混匀，回收乙醇，减压干燥，研细，过80目筛，即得。微丸的制备：固体分散物—微晶纤维素—淀粉—滑石粉3：0.6：0.3：0.1混合均匀，以适量5％（w）PVP水溶液为黏合剂，制软材，过20目筛制湿颗粒随后投入包衣锅。包衣锅转速设为90r／min，同时喷加少量粘合剂和混合粉，制得圆整性较好的微丸，40℃烘干后分样过筛，收取14～30目微丸。7肠溶微丸的评价和质量标准的研究从溶出曲线可以看出，微丸在胃液中2h没有药物释放，在人工小肠液中3h时，紫杉烷类化合物溶出9～14％，在人工结肠液中9h基本上释放完全。规定微丸按干燥品计，含紫杉醇不得少于4％，含三尖杉宁碱和红豆杉素Ⅳ得总量不得少于9％。结论：1．通过各种途径查阅中外文献资料及查新报告均未见有与本项目拟研究内容相同的研究报道。2．所建立的活性组分含量测定方法准确可行，重复性好，可用于紫杉醇、三尖杉宁碱、红豆杉素Ⅳ以及总黄酮的含量测定。3．通过对药材的研究，规定使用的原料药材为云南红豆杉（Taxus yunnanensis Cheng et L．K．Fu）的枝叶部分，以5年生以上为佳，贮藏时间为半年以下。4．提取工艺，初步除杂工艺和精制工艺是课题的关键所在，优选的工艺可以有效提取红豆杉中的有效组分，通过接取含紫杉烷类化合物及总黄酮，总木脂素等的大类成分，改变了传统的习惯的系统分离的收集方式，在一定程度上减少了有毒试剂的使用量，并大大缩短了过柱的周期，更加适合工艺化的大生产。大类成分的分离方法也更加符合中医药理论关于多成分多靶点的用药特点，并且其中含有的其他有效组分可望在配伍后发挥协同治疗的作用，并在一定程度上减轻毒副作用。5．体外结肠癌HCT—8和SW480细胞抑制试验证明三尖杉宁碱与红豆杉素Ⅳ对紫杉醇抗肿瘤有一定的协同作用，与文献吻合。6．采用适当的辅料和工艺，可制得提取物固体分散体的微丸，方法简便可行，重复性好。制得的微丸能够显著提高紫杉烷类化合物的溶出度，质量标准可有效地控制制剂的质量。从云南红豆杉枝叶中提取的抗肿瘤活性组分，经体外结肠癌细胞抑制实验证明其具有一定的生物活性。本课题为云南红豆杉枝叶的药材质量控制、抗癌活性组分的提取分离精制工艺、肠溶固体分散体的制备、微丸的制备提供了一定的参考依据；但部分研究工作尚未结束，下一步将对其药效和体内释药过程做更深入的探讨。
论文目录
相关论文文献
- [1].不同湿度条件下红豆杉种子生理生化特性变化规律研究[J]. 林业科技通讯 2020(01)
- [2].两种基于细胞捕获的红豆杉抗肿瘤活性成分筛选方法的研究[J]. 山西医科大学学报 2020(01)
- [3].滴灌条件下土壤基质势对红豆杉幼苗叶绿素荧光特性和生长的影响[J]. 灌溉排水学报 2020(06)
- [4].百岁新四军老战士的红豆杉不了情[J]. 国土绿化 2020(06)
- [5].麻沿林场红豆杉育苗技术培育试验[J]. 甘肃林业 2020(02)
- [6].太行山区红豆杉快速繁育技术[J]. 内蒙古林业 2020(08)
- [7].红豆杉种子育苗技术[J]. 农民致富之友 2019(01)
- [8].我国红豆杉药材人工培植研究及思考[J]. 重庆中草药研究 2018(02)
- [9].红豆杉的繁殖方法及栽培养护技术[J]. 农民致富之友 2019(12)
- [10].中国红豆杉营林及病虫害防治技术分析[J]. 绿色科技 2019(21)
- [11].中国红豆杉植株再生体系优化[J]. 草原与草坪 2019(05)
- [12].盆栽植物红豆杉对室内空气中二氧化硫污染的净化作用（英文）[J]. Agricultural Science & Technology 2017(11)
- [13].红豆杉繁殖技术[J]. 农业开发与装备 2018(01)
- [14].红豆杉多久能开花结果[J]. 林业与生态 2018(02)
- [15].花开红豆杉 情满六盘水[J]. 农业发展与金融 2018(01)
- [16].红豆杉[J]. 生物学教学 2015(12)
- [17].绥宁发现野生红豆杉群落[J]. 林业与生态 2016(12)
- [18].红豆杉栽培与繁殖[J]. 中国花卉园艺 2017(04)
- [19].龙上村的红豆杉群[J]. 国土绿化 2017(09)
- [20].仰望红豆杉[J]. 林业与生态 2015(12)
- [21].张家跃:将红豆杉功能发扬光大[J]. 中国花卉园艺 2015(20)
- [22].一心为了红豆杉[J]. 绿色中国 2015(22)
- [23].甘南高原野生红豆杉的生境及扦插繁育试验初报[J]. 林业科技通讯 2016(02)
- [24].一种“曼地亚”红豆杉的扦插方法[J]. 上海农业科技 2016(02)
- [25].红豆杉栽培技术及应用[J]. 现代农村科技 2016(15)
- [26].寂寂红豆杉[J]. 园林 2014(10)
- [27].千年红豆杉,硕果累累喜迎嘉宾[J]. 福建林业 2014(06)
- [28].一心为了红豆杉[J]. 国土绿化 2015(02)
- [29].甘南合作地区红豆杉引种繁育初报[J]. 特种经济动植物 2015(06)
- [30].百岁仙翁的“不了情”——安徽石台红豆杉保护[J]. 中华建设 2015(07)