β-TCP三维灌注生物反应器用于骨髓间充质干细胞扩增及成骨分化研究

论文摘要

目的:建立一套小规模MSC高效扩增反应器系统,在实验室水平快速扩增骨髓间充质干细胞,并同期建立成骨分化诱导及动力学研究方法,为临床骨损伤修复在短期获得定量组织、细胞数提供实验室向生产过渡。材料方法:（1）采用平行实验探索最佳的β-TCP支架制备处方和工艺,获得脆碎度、硬度、外观规则度、细胞悬液和培养基吸收效率最理想的片状支架。（2）在静态培养测试中,用廉价易贴壁的Vero进行接种,观察与2D平板培养相比较的扩增速率优势。（3）在实验室利用可观测双联小室设计并搭建体外灌注生物反应器。（4）将提取的2代大鼠骨髓间充质干细胞接种于平置支架材料上,先于二氧化碳培养箱中静置,完全贴附后开始连续灌注培养,于定期分别取样,与二维平板对照比较,CCK-8染色检测细胞生长趋势、迁徙率变化、ALP活性染色测试有无成骨诱导剂下的成骨诱导水平。干燥细胞-支架混合体,在扫描电镜下观察细胞生长状态、迁移能力和支架亲和水平。结果:（1）制备出平滑均匀、有一定强度和较低脆碎度、细胞悬液和培养基吸收高效、孔隙率达78%的β-TCP支架。（2）在3D静态培养比较2D培养中显示出后期更大的承载量和扩增速率。（3）反应器在流速15.7 ml/h左右能优效扩增间充质干细胞。（4）提取的大鼠MSCs在三维支架的灌注培养中,显示了空白支架独特的成骨诱导能力,并且相对于平板培养,CCK-8染色检测证明细胞扩增速率提高了约6-10倍,总体碱性磷酸酶活性大大提升,存在成骨诱导剂环境下,比ALP活性基本保持不变。此外,三维灌注条件下早期呈现整体迁徙率为主,晚期则以局部迁徙为主,其迁徙能力可满足骨科修复要求。电镜扫描显示出胞外基质的分泌使细胞集落与支架很好的亲和,并在层面结构显示出独特的生长适应性。结论:用优化的工艺和处方,可获得外观规则光滑、质地均匀坚韧、脆碎度低、耐浸泡、高生物亲和性的β-TCP三维支架,可供贴壁细胞贴附。采用双联小室配合β-TCP三维支架,可实现在实验室搭建三维连续灌注生物反应器,具备接种、取样、观察、考察迁徙率生长速率等功能,相对于二维平板,β-TCP三维支架可显著提高间充质干细胞扩增速度,材料本身可在接近饱和诱导的水平促进间充质干细胞成骨分化。单个细胞MSC存在成骨诱导剂时的分化能力与细胞比生长速率无直接关联。干细胞能在三维支架上分泌胞外基质,借以相互接触并融合在支架表面。三维支架层面结构相对于条状和柱状结构更有利于细胞的贴附与生长。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言部分
• 1.1 骨髓 MSC 及其扩增、分化研究简介
• 1.2 β-TCP 生物陶瓷材料简介
• 1.3 β-TCP 三维支架用于MSC 的研究最新进展
• 第一章 材料和方法部分
• 1.1 三维支架材料工艺研究
• 1.2 Vero 细胞三维培养测试
• 1.3 提取大鼠骨髓间充质干细胞及原代培养
• 1.4 设计搭建体外灌注反应器并检验可行性
• 1.5 利用生物反应器进行rMSC 生长动力学及分化研究
• 第二章 结果部分
• 2.1 三维支架材料工艺研究结果
• 2.2 Vero 细胞三维培养测试
• 2.3 大鼠骨髓间充质干细胞原代培养
• 2.4 搭建体外灌注反应器可行性结果
• 2.5 生物反应器培养rMSC 结果
• 第三章 讨论部分
• 3.1 三维支架材料工艺研究部分
• 3.2 Vero 细胞三维培养测试讨论
• 3.3 rMSC 细胞原代培养讨论
• 3.4 体外搭建生物反应器测试讨论
• 3.5 rMSC 三维灌注培养讨论
• 第四章 结论部分
• 4.1 三维支架制备可行性
• 4.2 三维反应器搭建可行性
• 4.3 三维灌注扩增、分化骨髓间充质干细胞优效性
• 4.4 总结展望
• 本文英文缩写略表
• 附：拓展试验简介及结果
• 参考文献
• 致谢部分
• 硕士期间发表或接受录用论文及专利