催乳素对体外培养奶牛成骨细胞作用的研究

论文摘要

目的:观察不同浓度催乳素对体外培养的奶牛成骨细胞增殖、分化、蛋白分泌及相关蛋白基因表达功能的影响。方法:无菌取出新生奶牛的肋骨,采用组织块培养法获取成骨细胞,进行原代、传代培养,取第二代细胞通过形态学观察、碱性磷酸酶染色、钙化结节染色等方法鉴定后作为试验模型,将用含20%胎牛血清的DMEM培养液配制的不同浓度的催乳素（0.01、0.1、1.0、10.0μg╱mL）与第二代奶牛的成骨细胞共同培养。采用MTT法观察催乳素对成骨细胞增殖功能的影响（用波长570nm处OD值表示）;氨基安替吡啉测酚法（金氏法）观察对成骨细胞分化功能的影响（用碱性磷酸酶活性表示）;放射免疫法观察对成骨细胞分泌骨钙素和肿瘤坏死因子-α的影响（用放免活性单位—ng/mL表示）;RT-PCR法观察对成骨细胞骨钙素mRNA和肿瘤坏死因子-αmRNA表达影响。结果:采用组织块培养法获得的细胞具有典型成骨细胞的形态特征,细胞碱性磷酸酶染色呈阳性且阳性率达90%以上,钙化结节经茜素红染色呈阳性,符合成骨细胞的生物学特性,表明培养的细胞为高纯度的成骨细胞。加催乳素培养后测定细胞的增殖结果显示:不同浓度的催乳素均表现为抑制成骨细胞的增殖作用。0.1、1.0、10.0μg/mL试验组与对照组比较差异不显著（P＞0.05）,0.01μg╱mL试验组与对照组比较差异极显著（P＜0.01）,各浓度催乳素抑制奶牛成骨细胞的增殖作用不存在时间-效应关系。加催乳素培养后测定碱性磷酸酶（ALP）活性结果显示:不同浓度的催乳素均表现为抑制成骨细胞碱性磷酸酶的分泌。与对照组相比,0.1、1.0、10.01μg/mL试验组均可抑制碱性磷酸酶的分泌,但与对照组比较差异不显著（P＞0.05）,0.01μg/mL试验组与对照组比较差异极显著（P＜0.01）。加入不同浓度催乳素培养7d后,0.1、1.0、10.0μg╱mL试验组表现为抑制骨钙素的分泌,与对照组比较差异不显著（P＞0.05）;0.01μg╱mL试验组则表现为促进骨钙素的分泌,与对照组比较差异极显著（P＜0.01）。加入不同浓度催乳素培养7d后,较对照组,肿瘤坏死因子-α的分泌均呈不同程度增多,其中1.0μg╱mL和10.0μg╱mL试验组与对照组比较差异显著（P＜0.05）,0.01μg╱mL和0.1μg╱mL试验组与对照组比较差异极显著（P＜0.01）。催乳素作用10d后提取细胞总RNA,进行RT-PCR检测BGP mRNA和TNF-αmRNA表达情况,试验结果显示:0.1、1.0、10.0μg/mL试验组较对照组BGP mRNA表达量均降低,0.01μg╱mL试验组较对照组BGP mRNA表达量升高;0.01、0.1、1.0、10.0μg╱mL试验组较对照组TNF-αmRNA表达量均升高。结论:在一定浓度范围内（0.01μg╱mL～10.0μg╱mL）,催乳素抑制体外培养奶牛成骨细胞的增殖。在一定浓度范围内（0.01μg╱mL～10.0μg╱mL）,催乳素抑制体外培养奶牛成骨细胞的分化。在一定的浓度范围内（0.01μg╱mL～10.0μg╱mL）,低浓度催乳素促进成骨细胞BGP蛋白的分泌,而高浓度催乳素则抑制成骨细胞BGP蛋白的分泌。在一定浓度范围内（0.01μg╱mL～10.0μg╱mL）,催乳素使成骨细胞TNF-α蛋白的分泌均呈不同程度增多。一定的浓度范围内（0.01μg╱mL～10.0μg╱mL）,催乳素对成骨细胞BGP和TNF-αmRNA表达的影响趋势,同催乳素干预成骨细胞分泌相关蛋白的趋势一致。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 催乳素结构及其功能研究概况
• 1.1 催乳素的结构
• 1.2 催乳素的分泌及其分泌水平的调节
• 1.2.2 催乳素释放因子
• 1.2.3 外周激素的调节
• 1.2.4 催乳素自身反馈调节
• 1.3 催乳素的相关功能
• 1.3.1 对乳腺与泌乳的作用
• 1.3.2 维持黄体功能的作用
• 1.3.3 对性腺的作用
• 1.3.4 对免疫功能的调节作用
• 1.3.5 参与应激反应
• 1.3.6 其它作用
• 1.4 催乳素的研究展望
• 2 成骨细胞简介
• 2.1 成骨细胞的来源
• 2.1.1 骨
• 2.1.2 骨外膜
• 2.1.3 骨髓
• 2.1.4 软骨的成骨潜能
• 2.1.5 异位骨化
• 2.2 成骨细胞的结构及其功能
• 2.3 成骨细胞性骨形成的调控机制
• 2.3.1 胰岛素样生长因子（IGFs）
• 2.3.2 转化生长因子（TGF-β）
• 2.3.3 骨形态蛋白（BMPs）
• 2.3.4 白细胞介素-1（IL-1）
• 2.3.5 肿瘤坏死因子-α（TNF-α）
• 2.3.6 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）
• 2.3.7 血管内皮生长因子（VEGF）
• 2.3.8 溶血磷脂酸（LPA）
• 2.3.9 成骨细胞因子45（OF45）
• 2.3.10 生长肽（OGP）
• 2.3.11 心结合因子-α1（CBF-α1）
• 2.4 成骨细胞的体外培养
• 2.5 体外成骨细胞分离培养在骨组织工程中的应用
• 2.6 成骨细胞发展前景展望
• 目的和意义
• 材料与方法
• 1 试验动物
• 2 试验试剂及配制
• 3 器材的处理
• 3.1 常规玻璃器皿的清洗与消毒
• 3.2 细胞培养瓶的清洗与消毒
• 3.3 橡胶制品的清洗与消毒
• 3.4 塑料器皿的清洗与消毒
• 3.5 正压除菌滤器的清洗与消毒
• 3.6 总RNA提取器械的处理
• 3.6.1 塑料制品
• 3.6.2 玻璃和金属制品
• 3.6.3 电泳槽
• 3.6.4 移液器
• 3.6.5 溶液
• 4 试验仪器和设备
• 5 成骨细胞的培养
• 5.1 原代培养
• 5.2 传代培养
• 6 成骨细胞鉴定
• 6.1 形态学观察
• 6.2 碱性磷酸酶染色
• 6.3 矿化结节染色
• 7 指标的观察
• 7.1 成骨细胞生长曲线的测定
• 7.2 催乳素对成骨细胞增殖的影响
• 7.3 催乳素对成骨细胞分化的影响
• 7.4 催乳素对成骨细胞骨钙素与肿瘤坏死因子-α分泌的影响
• 7.5 催乳素对成骨细胞骨钙素和肿瘤坏死因子-α基因表达的影响
• 7.5.1 催乳素干预试验
• 7.5.2 成骨细胞总RNA的提取
• 7.5.3 骨钙素、肿瘤坏死因子-α及内参β-actin基因的引物合成
• 7.5.4 RT-PCR
• 7.6 数据处理
• 结果
• 1 活细胞观察以及碱性磷酸酶和矿化结节染色定性
• 1.1 成骨细胞形态学观察
• 1.2 碱性磷酸酶染色定性
• 1.3 矿化结节染色定性
• 2 成骨细胞生长曲线测定
• 3 催乳素对成骨细胞增殖活性的影响
• 4 催乳素对成骨细胞分化的影响
• 5 催乳素对成骨细胞骨钙素分泌的影响
• 6 催乳素对成骨细胞肿瘤坏死因子-α分泌的影响
• 7 催乳素对成骨细胞骨钙素和肿瘤坏死因子-α基因表达的影响
• 讨论
• 1 关于成骨细胞体外培养试验
• 2 催乳素在骨代谢中的作用
• 3 催乳素对成骨细胞增殖的影响
• 4 催乳素对成骨细胞分化的影响
• 5 催乳素对成骨细胞骨钙素分泌的影响
• 6 催乳素对成骨细胞肿瘤坏死因子-α分泌的影响
• 7 催乳素对成骨细胞骨钙素和肿瘤坏死因子-α基因表达的影响
• 7.1 对骨钙素mRAN的表达影响
• 7.2 对肿瘤坏死因子-α mRAN的表达影响
• 结论
• 参考文献
• 致谢