论文摘要
第一部分Thy-1肾炎大鼠肾内补体C5b-9复合物沉积与其凋亡病变的关系分析目的:复制人类系膜增生性肾炎（mesangial proliferative glomerulonephritis,MsPGN）动物模型,即大鼠Thy-1肾炎（Thy-1 nephritis,Thy-1 N）模型,观察Thy-1 N大鼠肾小球内补体C5b-9复合物的沉积情况及其不同阶段的病理变化,探讨C5b-9复合物在Thy-1 N大鼠肾小球内的沉积和Thy-1 N病变规律。同时,研究耗竭补体对Thy-1 N凋亡病变的影响,并在体外观察用C5b-9复合物刺激培养的肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cells,GMCs）能否诱导细胞凋亡的情况。探讨C5b-9复合物的沉积与凋亡病变之间的相关关系。方法:（1）利用Thy-1抗体（Thy-1 antibody,Thy-1 Ab）复制大鼠Thy-1 N模型,并用眼镜蛇毒因子（Cobra venom factor,CVF）耗竭补体。大鼠随机被分为3组,即Thy-1 N组、CVF+Thy-1 N组和正常对照组。取各组大鼠肾皮质,行光镜、电镜和TUNEL染色检查判断其肾小球细胞的病理变化。（2）在质控亚溶解型C5b-9复合物（sublytic C5b-9）形成的基础上,将体外培养的GMCs作不同的分组处理,经Annexin V（AV）-propidiumiodide（PI）双染后,应用流式细胞仪定量分析GMCs凋亡变化。结果:（1）免疫组化染色显示,实验40 min时,Thyv1 N大鼠肾小球内即可见补体C5b-9复合物的沉积,主要分布于肾小球系膜区及GMCs表面,3 h时更为显著。此时,被C5b-9沉积包绕的GMCs并未发生溶解坏死,但随着病程的进展,有C5b-9沉积的GMCs逐渐减少,C5b-9染色强度亦逐渐减弱,7 d时C5b-9染色与对照组之间已无明显差异。（2）Thy-1 N大鼠光镜下可见24 h时肾小球细胞溶解坏死,数量下降;病程7 d,肾小球细胞数显著增多;电镜下,实验40 min时,GMCs呈现凋亡改变,24 h时GMCs已有溶解,7 d时GMCs明显增生,细胞外基质（extracellular matrix,ECM）也显著积聚。TUNEL检查证实,实验40 min和3 h时,凋亡细胞阳性着色较多,亮度较强;随着病程的进展,凋亡细胞明显减少且荧光强度显著下降。应用CVF耗竭补体,能显著减轻Thy-1 N早期的GMcs凋亡病变。（3）流式细胞仪定量分析显示,体外培养的GMCs用sublytic C5b-9复合物刺激亦能诱导细胞发生凋亡。结论:（1）Thy-1 N早期大鼠GMcs表面有亚溶解型补体C5b-9复合物的沉积。（2）Thy-1 N大鼠肾组织病变确实存在凋亡、坏死和继发增生三个时相,早期以凋亡病变为主。（3）补体C5b-9复合物与大鼠Thy-1 N早期GMCs凋亡病变有一定的关系。第二部分基因芯片筛查体内和体外同期共表达凋亡相关基因目的:（1）筛选Thy-1 N大鼠发病早期40 min和3 h时肾组织和体外用亚溶解剂量的C5b-9复合物（sublytic C5b-9）刺激40 min和3 h时GMCs的基因谱变化,寻找体内外同期共表达差异基因。（2）检查凋亡相关基因——IRF-1（interferon regulatory factor 1）mRNA丰度和蛋白表达水平,从基因层面上探讨Thy-1 N大鼠GMCs凋亡的可能原因。方法:采用大鼠Thy-1 N模型作为体内模型,sublytic C5b-9刺激的GMCs作为体外模型,应用基因芯片杂交技术筛选Thy-1 N大鼠发病40 min和3 h时肾组织和sublytic C5b-9刺激40 min和3 h时GMCs的基因谱变化,寻找体内外同期共表达差异基因,并登陆Affymetrix公司网站和Genebank,在其提供的数据库中进行分析,获取相关功能信息。选择体内外同期共表达上调且可能与凋亡相关的IRFv1基因,应用RT-PCR、real-time PCR、Western blotting和免疫组化技术分析其mRNA丰度和蛋白表达水平。结果:（1）基因芯片显示,在15923个基因中,Thy-1 N大鼠肾组织上调基因在40 min时为667个,3 h时为173个,其中部分是凋亡相关的基因和调控基因,部分为信号转导相关的基因及一些组织增生相关基因;肾组织下调基因在建模40min时为14个,3 h时为33个,其中一些是酶类基因,部分为生长因子和细胞因子受体基因等。体外用sublytic C5b-9刺激诱导的GMCs在40 min时上调基因为536个,3 h时为486个,包括凋亡相关的基因和调控基因、信号转导相关基因、增生相关基因等;下调基因在诱导40 min时为397个,3 h时为494个,其中部分为酶类和细胞因子及受体相关基因和一些未知基因等。（2）将Thy-1 N大鼠肾组织变化的基因谱系与sublytic C5b-9诱导的GMCs相关基因谱系进行同期比对,找出体内和体外同期共表达上调基因10个,即:IRF-1,activatingtranscription factor 3（ATF3）,connective tissue growth factor（CTGF）,heme oxygenase 1（HO-1）,growth arrest and DNA-damage-inducible 45（Gadd 45）,dual specificity phosphatase 1（MKP-1）,schlafen 3,enhancerbinding protein（C/EBP）,Cyclin L1 and V-jun sarcoma virus 17oncogene homolog（avian）。（3）应用RT-PCR和real-time PCR检测IRF-1 mRNA丰度,结果显示,体内外实验40 min和3 h,IRF-1 mRNA表达均显著高于对照组,且实验3 h,IRF-1 mRNA水平较40 min时明显增多。与芯片杂交信号强度的Signal Log Ratio（SLR）值趋势一致。应用Western blotting和免疫组化技术测定IRF-1蛋白表达水平,结果表明,体内实验3 h时,肾组织中IRF-1蛋白明显表达;体外实验40 min和3 h,sublytic C5b-9刺激的GMCs中IRF-1蛋白水平也显著高于对照组,另实验3 h,IRF-1蛋白表达水平较40 min时明显增多,且主要分布在细胞核内。结论:Thy-1 N发病涉及众多基因的异常表达,而IRF-1基因属于体内（Thy-1 N模型）和体外（sublyticC5b-9刺激GMCs模型）同期共表达上调基因。第三部分IRF-1在sublytic C5b-9诱导GMCs凋亡中的作用及其机制目的:从基因水平上探讨干扰素调节因子1（IRF-1）对sublytic C5b-9诱导GMCs凋亡的影响及其可能涉及的分子机制（或下游通路）。方法:（1）根据IRF-1基因序列设计引物,应用RT-PCR扩增全长的IRF-1基因,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1-myc,构建真核表达质粒pcDNA3.1/IRF-1一-myc。并经亚克隆,构建pcDNA3.1/IRF-1-GFP真核表达质粒。（2）体外将pcDNA3.1/IRF-1质粒或dominant negative IRF-1（pcDNA3.1/dnIRF-1）质粒转染GMCs,筛选pcDNA3.1/IRF-1和pcDNA3.1/dnIRF-1转染最佳时间,并将GMCs作相应的分组处理。（3）应用Hoechst 33342染色检查各组GMCs的凋亡形态,流式细胞仪定量分析DNA含量和细胞周期分布;另外ELISA法检测各组GMcs及其相应抗体中和后的GMCs培养上清中干扰素-β（IFN-β）、IFN-γ的含量。此外,利用人工底物法检查各组GMCs的活性Caspase-3/7水平。结果:（1）成功构建pcDNA3.1/IRF-1真核表达质粒。（2）Sublytic C5b-9刺激的GMCs和转染pcDNA3.1/IRF-1质粒的GMCs均呈现核Hoechst 33342染色致密增强或碎裂等凋亡形态学的改变,DNA组方图上出现“亚G1”峰,凋亡率增加,细胞周期阻滞在G1期,培养上清中IFN-β、IFN-γ的含量以及GMCs中的活性Caspase-3/7水平明显升高;pcDNA3.1/IRF-1质粒转染的GMCs再给予sublytic C5b-9刺激后,上述现象更为明显。与之相反,转染pcDNA3.1/dnIRF-1质粒的GMCs再给予sublytic C5b-9刺激后,凋亡率显著降低,培养上清中IFN-β的含量以及GMCs中的活性Caspase-3/7水平均明显下调。但是,中和IFN-β、IFN-γ并不能减少sublytic C5b-9和IRF-1所致的GMCs凋亡。结论:Sublytic C5b-9诱导GMCs的凋亡与上调的IRF-1增加Caspase-3/7的合成有一定的关系。
论文目录
相关论文文献
- [1].AGEs/RAGE/SphK1信号通路介导马钱苷抗AGEs损伤GMCs的机制研究[J]. 南京中医药大学学报 2017(04)
- [2].氧化型脂蛋白(a)对大鼠GMCs增生及ICAM-1表达的影响[J]. 中国热带医学 2008(03)
- [3].黄芪、水蛭及其配方含药血清对脂多糖诱导增生的大鼠GMCs中NF-κB p65、MMP-2 mRNA表达的影响[J]. 江苏中医药 2019(05)
标签：系膜增生性肾炎论文; 肾炎论文; 眼镜蛇毒因子论文; 肾小球系膜细胞论文; 亚溶解剂量复合物论文; 凋亡论文; 亚溶解剂量的复合物论文; 基因芯片论文; 干扰素调节因子论文; 干扰素论文; 半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶论文;