论文摘要
目的化疗一直是以手术为主的大肠癌综合治疗的重要手段,而多药耐药（multidrug resistance, MDR）是临床化疗效果不佳的主要原因,多药耐药的发生机制之一是多药耐药相关蛋白2（multidrug resistance associated protein2,MRP2）基因以及蛋白（ABCC2蛋白）的高表达。RNA干扰（RNA interference,RNAi）自1998年Fire等[1]首次报道以来已成为一种特异性抑制靶基因表达的有效工具。本研究通过构建MRP2基因的小干扰RNA（small interfere RNA, siRNA）真核表达载体,观测其对MRP2基因的沉默作用,探讨应用RNA干扰逆转肿瘤耐药的可能性,探索促进肿瘤治疗的新策略,为进一步实验提供技术手段。方法1针对MRP2基因序列,筛选,设计,合成siRNA相关基因片段,构建高特异性Pgenesil-1-MRP2-siRNA,酶切鉴定及测序验证插入序列正确性。2脂质体法将Pgenesil-1-MRP2-siRNA转染至结肠癌耐长春新碱细胞株（HCT-8/V细胞株）,用定量RT-PCR和Western blot检测siRNA阻断MRP2的表达效率。3 MTT实验测定Pgenesil-1-MRP2-siRNA和长春新碱对HCT-8/V细胞增殖抑制作用。结果1成功构建出针对MRP2基因的siRNA表达载体:Pgenesil-1-MRP2-siRNA。2用脂质体法成功转染至HCT-8/V细胞,通过定量RT-PCR和Western blot检测靶细胞MRP2-mRNA及蛋白（ABCC2蛋白）表达均较对照组明显下降,其受抑制率分别为68.6%和75.9%（P<0.05）。3在相同浓度化疗药物的作用下,MTT分析结果显示RNA干扰组细胞凋亡比例高于对照组（P<0.05）,表明细胞耐药性下降。结论1应用表达载体法成功构建针对MRP2基因的siRNA表达载体:Pgenesil-1-MRP2-siRNA。2重组质粒Pgenesil-1-MRP2-siRNA经脂质体法转染HCT-8/V细胞后能显著的发挥基因沉默作用,使HCT-8/V细胞对化疗药物敏感性增加,取得良好的逆转耐药效果。
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