柞蚕细胞色素P450基因CYP4G25序列的克隆与表达分析

论文摘要

细胞色素P450单加氧酶系（cytochrome P450monooxygenases，P450s）为广泛分布于生物有机体内的重要酶系。细胞色素P450基因起源于35亿年前的一个共同祖先，是最古老和最庞大的超基因家族之一。细胞色素P450参与许多重要的生命过程，对动物、植物、真菌和细菌等的研究表明许多不同催化反应都有细胞色素P450的参与。对于昆虫而言，细胞色素P450在昆虫的生命活动中起着十分重要的作用：主要涉及生长、发育、取食等过程，其对异生物质的代谢特性导致了昆虫对杀虫剂的抗药性和对植物有毒物质的耐受性，它还参与了昆虫体内保幼激素、蜕皮激素和脂肪酸等内源化合物的合成与代谢，具有重要的生物学和遗传学意义。柞蚕是一种正在开发的野生绢丝昆虫，属于鳞翅目、大蚕蛾科、柞蚕属的泌丝昆虫。除了作为纺织工业原料利用外，还有很高的药用和食用等经济价值。利用分子生物学和生物信息学方法对柞蚕P450基因进行研究，获得的主要结果如下：1．CYP4G25基因的克隆及序列分析：采用RT-PCR和RACE-PCR方法克隆获得了1个P450新基因CYP4G25的全长序列。CYP4G25全长2112bp，GenBank登录号为GU205081，包括由111个核苷酸组成的5’端非编码区（5’UTR）、由1674个核苷酸组成的ORF（开放阅读框）编码557个氨基酸，分子量大小为63.6KD和等电点为8.6，以及由326个核苷酸组成的3’端非编码区（3’UTR）。通过生物在线网站Expasy分析氨基酸序列：含有血红素结合位点，螺旋I、螺旋K、螺旋C以及N端含有由22个疏水氨基酸组成的跨膜锚定区域。构建系统进化树分析得到柞蚕和天蚕亲缘关系最近。2. CYP4G25基因的表达分析：提取柞蚕不同时期和不同组织的总RNA，以M-MLV反转录第一链cDNA，以柞蚕Actin基因做内参，进行了半定量RT-PCR。实验结果显示，选取的组织基本都有表达，在脂肪体、表皮。中肠、血液、丝腺、触角、精巢和卵巢，且表达量无明显差异。RT-PCR法扩增了柞蚕细胞色素CYP4G25的ORF，并连接至pET-28a（+）表达载体，转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，用IPTG进行了不同浓度的诱导表达，经SDS-PAGE电泳和Western blot检测，表明被诱导的目的蛋白均得到了稳定的表达，这为以后对细胞色素CYP4G25的真核表达及其功能的进一步研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 细胞色素 P450 研究进展
• 1.1.1 细胞色素 P450
• 1.1.2 细胞色素 P450 结构特征
• 1.1.3 细胞色素 P450 的组织分布
• 1.1.4 细胞色素 P450 的命名
• 1.1.5 昆虫细胞色素 P450 的功能
• 2 引言
• 2.1 研究的目的及意义
• 2.2 主要研究内容
• 2.2.1 柞蚕 CYP4G25 基因全长 cDNA 序列的测定和分析
• 2.2.2 柞蚕 CYP4G25 基因转录水平的研究
• 2.2.3 柞蚕 CYP4G25 蛋白表达水平的研究
• 2.3 技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 仪器与试剂
• 3.2.1 主要实验仪器
• 3.2.2 主要生化试剂
• 3.2.3 常用溶液的配置
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 柞蚕组织的收集
• 3.3.2 柞蚕总 RNA 的提取
• 3.3.3 提取的总 RNA 的质量检测
• 3.3.4 第一链 cDNA 的合成
• 3.3.5 柞蚕 CYP4G25 基因的 PCR 扩增
• 3.3.6 PCR 扩增后目的产物的纯化
• 3.3.7 感受态细胞的制备
• 3.3.8 目的片段的连接和转化
• 3.3.9 柞蚕 CYP4G25 基因序列的拼接与分析
• 3.3.10 柞蚕 CYP4G25 蛋白完整 ORF 的原核表达
• 3.3.10.1 柞蚕 CYP4G25 基因全长 cDNA 的扩增
• 3.3.10.2 原核表达载体的构建
• 3.3.10.3 蛋白的诱导表达
• 3.3.10.4 SDS-PAGE 电泳分析
• 3.3.11 Westernblot 分析
• 3.3.12 柞蚕 P4504G25 序列与氨基酸序列同源性分析和系统进化树构建
• 3.3.13 柞蚕 CYP4G25 基因转录水平的研究
• 3.3.13.1 柞蚕 CYP4G25 基因的半定量 PCR 检测
• 4 结果
• 4.1 总 RNA 的检测
• 4.2 柞蚕 CYP4G25 基因序列的测定和分析
• 4.3 柞蚕 P450CYP4G25 序列与氨基酸序列同源性分析和系统进化树构建
• 4.4 柞蚕 P450CYP4G25 基因转录水平的研究
• 4.5 原核表达载体的构建
• 4.5.1 柞蚕 CYP4G25 全长 ORF 的扩增
• 4.5.2 双酶切鉴定
• 4.5.3 柞蚕 CYP4G25 蛋白不同 IPTG 浓度的诱导表达
• 4.6 Westernblot 检测
• 5 讨论
• 5.1 柞蚕的饲养
• 5.2 柞蚕 CYP4G25 基因全长与序列分析
• 5.3 柞蚕 CYP4G25 基因的半定量 PCR 检测
• 5.4 柞蚕 CYP4G25 蛋白的原核表达
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 读研期间发表的论文