论文摘要
前列腺癌是欧美国家男性发病率最高,死亡率第二的恶性肿瘤。每年诊出为前列腺癌的美国男性达到将近20万人,其中约3万人死于前列腺癌。在我国,前列腺癌在男性泌尿系统肿瘤中发病率排名第三。随着我国人口老龄化的趋势和生活方式的改变,前列腺癌的发病率正逐年上升。前列腺是一个雄激素依赖性器官,雄激素撤除治疗对于前列腺癌早期有效,但是患者往往会在这样的治疗后约两年时间发展为雄激素非依赖性,雄激素撤除治疗便失去了作用,肿瘤往往会获得更强的侵袭性和转移能力。LNCaP是具有代表性的前列腺癌细胞系,C4-2和C4-2B细胞是由LNCaP演变而来的细胞系。将LNCaP接种于裸鼠皮下8周并将裸鼠去势,4周后取出肿瘤接种于裸鼠皮下,再次将裸鼠去势。这样就得到了C4-2和C4-2B细胞,它们与LNCaP细胞遗传背景相同,但却获得了雄激素非依赖的生长能力,并具有更强的成瘤性和骨转移能力。LNCaP、C4-2和C4-2B细胞很好地模拟了临床上患者的病情发展过程,是国际上承认的前列腺癌研究细胞模型。为了寻找能有效预示前列腺癌进展的分子标志物,同时为了能阐明前列腺癌发展以及雄激素非依赖性的分子机制,本研究比较了LNCaP、C4-2和C4-2B这三种前列腺癌细胞胞外蛋白质组,并研究了部分差异蛋白在前列腺癌细胞系和患者组织中的表达情况,受调控情况以及可能参与肿瘤进展的功能与机制。本研究利用双向电泳结合质谱的经典蛋白质组学研究手段,对LNCaP、C4-2和C4-2B这三种前列腺癌细胞的胞外蛋白质组进行了分离、比较和鉴定。共成功鉴定得到了16个蛋白质,其中双向电泳图谱上在C4-2和C4-2B胞外水平均高于LNCaP的差异蛋白共有6个,包括:PSA、IGFBP2、uMtCK、PGK1、PRDXⅠ和DNM2（isoform 4, variant）。其中PSA是目前临床上最为广泛使用的肿瘤标志物,IGFBP2是被广泛关注的潜在前列腺癌雄激素非依赖性标志物。在这16个分子中,PPⅠA在胞外已被证明有生长因子的作用;已有数篇基于蛋白质组学的文献报道过PEBP1、PRDX 1和TPI都可以很容易地在细胞胞外被检测到,这与本研究的结果是一致的;而且许多蛋白如GLOⅠ、PGK1和PRDXⅠ等等都是已知对肿瘤发生发展有促进作用或可以作为标志物的蛋白质。而后本研究在转录水平上对部分结果进行了比较,利用相应蛋白的商业化抗体直接验证了uMtCK和PGK1在LNCaP与C4-2和/或C4-2B细胞胞外的差异表达。本研究还将部分胞外蛋白的基因表达序列构建于真核表达载体上,瞬时转染293细胞,而后收集细胞培养液进行检测,发现PRDX1可以在293胞外检测到,提示其可能是一个新的分泌蛋白。本研究所发现的这些前列腺癌胞外蛋白有可能在临床上有一定的应用价值,尚需进一步的探索和证实。通过比较发现,线粒体肌酸激酶（uMtCK）在C4-2和C4-2B的胞内以及前列腺癌患者的组织中均表现为高表达。在LNCaP细胞中,uMtCK可以受到雄激素拮抗剂Bic的诱导而上调表达,并可以在细胞拥挤的压力下表达明显增高。这些都提示uMtCK可能在雄激素撤除的情况下或者是在肿瘤细胞处于压力的时候参与了前列腺癌的进展过程。于是,本研究构建了稳定过表达uMtCK的LNCaP细胞（LNCaP-uMtCK）,对uMtCK的功能和可能参与的促进肿瘤发展的机制进行了探索。结果显示,无论是8%FBS正常培养条件还是在加入20μM雄激素拮抗剂Bic的条件下,LNCaP-uMtCK都比对照细胞LNCaP-neo具有更强的生长优势,并且表现为对雄激素的不敏感和对顺铂的轻微但有意义的抵抗性。细胞周期检测发现,LNCaP-uMtCK细胞S期的比例高于LNCaP-neo,并且LNCaP-uMtCK细胞中CyclinD1表达升高。而后本研究利用Western和PSA-luc对雄激素受体的表达和活性进行了检测,结果显示,在8%FBS正常培养条件下,LNCaP-uMtCK的雄激素受体的表达水平和活性较对照相比都是降低的,且其活性在1nM的人工合成雄激素R1881的刺激后仍然低于LNCaP-neo,这表明在此状态下细胞生长的优势并不是通过激活雄激素受体而获得的。进一步对机制的探索表明,与对照细胞相比,LNCaP-uMtCK细胞的线粒体膜电位和活性氧水平都是增高的,升高的活性氧并没有使得细胞走向调亡,相反地,它可能通过多条信号通路促进了细胞的生长。通过对PI3K-Akt信号通路的检测,本研究发现LNCaP-uMtCK中Akt（Ser473）和GSK3β（Ser9）磷酸化水平是增高的。虽然缺少直接的证据,但是ROS很可能是通过活化包括PI3K-Akt在内的多条信号通路来促进LNCaP-uMtCK生长的。在长期培养20代以上,LNCaP-uMtCK细胞出现了异倍体,这很可能是ROS长期作用对基因组损伤的一个结果,其细胞特性和异倍体发生的机制有待进一步详细阐明。总之,因压力途径或Bic药物刺激而上调表达的uMtCK可能通过升高的ROS对于前列腺癌的发生发展起到了一定的促进作用。