论文摘要
T细胞增殖分化是免疫应答的中心环节。但T细胞的异常增殖分化在移植排斥反应以及类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）、多发性硬化（multiple sclerosis,MS）、溃疡性肠炎（ulcerative colitis, UC）与银屑病（psoriasis, PsA）等自身免疫性疾病的发生发展过程中扮演着非常重要的角色。抑制T细胞增殖分化与发挥生物学功能的免疫抑制剂革命性改变了这些疾病的临床治疗效果,使越来越多患者的病情能够达到临床缓解。但是,这些疾病均属多因素诱发、多种细胞参与并涉及多条信号转导通路的复杂疾病。不同患者的诱发原因、发病机制以及对药物的敏感性,存在显著个体差异。治疗过程中发现单一疗法效果不明显时,还需给予联合、轮换或序贯治疗。继续探索疾病的发病机制,发现更多的治疗靶点和全新结构的先导化合物,将为患者提供更多的选择与希望。本实验室首先建立了检测小鼠脾细胞与人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）增殖的方法,从中药、植物、微生物代谢产物及合成的化合物库中筛选具有免疫抑制活性的新型小分子化合物。然后,在纯化的T细胞中,探索筛选得到的新型小分子化合物的作用机制,包括细胞毒性、对IL-2产生与CD25表达的影响、对细胞周期的影响以及可能作用的信号转导通路。最后,在T细胞介导的小鼠迟发型超敏反应（delayed-typehypersensitivity reaction, DTH）模型中,证实它的体内活性。本研究分3部分,兹分述如下。第1部分筛选具有免疫抑制活性的新型小分子化合物从中药、植物、微生物代谢产物及合成的化合物库中筛选具有免疫抑制活性的新型小分子化合物是本实验室的研究方向之一。我们建立了使用流式细胞术在细胞水平进行免疫抑制活性高通量筛选的技术平台。不仅从中药、植物、微生物代谢产物中筛选具有免疫抑制活性的新型天然小分子化合物,还通过化学合成,不断积累新结构的合成小分子化合物,期望从中发现新型免疫抑制剂。苯并噻唑类衍生物是一类芳香族杂环化合物,既往的研究主要集中于抗肿瘤、抗菌、抗惊厥以及抑制原卟啉原氧化酶等方面,但尚未发现有关免疫抑制活性的报道。我们合成了一组新型苯并噻唑类衍生物。免疫抑制活性筛选显示,在这些新型苯并噻唑类衍生物中,BD711、BD713、BD750、BD751、BD753、 BD755、BD756、BD757、BD759、BD760、BD761、BD763以及BD764可抑制ConA刺激的小鼠脾细胞与PHA刺激的人PBMC增殖。其中,BD750活性最高。但BD752、BD754、BD758、BD762、BD765、BD771、BD774、BD779以及BD782没有抑制能力。因此,并非所有的苯并噻唑类衍生物都具有抑制活性,是否具有抑制活性以及活性的强弱与苯并噻唑类衍生物中的某些化学基团密切相关。本研究发现的这类以BD750为代表的新型苯并噻唑类衍生物的结构完全不同于目前临床上使用的所有小分子免疫抑制剂,如环孢素A（ciclosporin A, CsA）、他克莫司（FK506）、雷帕霉素（rapamycin,RAPA）、麦考酚酸酯（mycophenolate mofetil, MMF）与霉酚酸钠（（?）nycophenolate sodium, MPS）等,也不同于尚处临床试验阶段的激酶抑制剂,如Tofacitinib （CP-690,550）、 ASP-015K与INCB018424等,按照结构生物学的原理,结构决定靶点与功能。BD750可能作用于已知的信号通路和靶细胞,但也可能作用于新的靶点。因此,观察BD750的生物学效应及其规律,不仅有助于探索其体内外作用机制,作为评估未来临床适应证,发展为先导化合物的重要实验依据。更重要的是,以BD750为探针将为探索T细胞介导的免疫疾病发病机制和治疗策略,打开一扇新的窗口。第2部分苯并噻唑衍生物BD750抑制T细胞增殖的作用机制研究作为先导化合物,新型苯并噻唑衍生物BD750已经具有较高的活性。但要成为成熟的免疫抑制药物,寻找或设计具有更高活性的BD750类似物是必经之路。经过结构修饰后,BD750的衍生物可能具有更高抑制活性。这在免疫抑制剂的研究历史中十分常见。目前进入Ⅲ期临床的新型免疫抑制药物CP690550源自对CP-352664的结构修饰。CP-352664抑制合淋巴细胞反应的IC50超过5μM。2010年FDA批准的新型免疫抑制剂FTY720,源自对冬虫夏草培养液中鞘氨醇样物质ISP-1的结构修饰,而最初发现ISP-1具有抑制人淋巴细胞增殖活性时,其IC50超过10μM。但是,倘若没有找到BD750的作用靶分子,就无法进行基于靶分子的、有目的的药物设计与改造,只能从已有或随机合成的BD750类似物中寻找免疫抑制活性更强的化合物。因此,目前需解决的核心问题是明确BD750的作用机制。本研究采用羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯（5-carboxyfluorescein diacetate succinimide ester, CFSE）结合流式细胞术的经典方法证实BD750抑制抗CD3/CD28mAbs刺激的人T细胞增殖与混合淋巴细胞反应,IC50分别为1.1±0.2μM与1.3±0.2μM。另外,BD750还可抑制抗CD3/CD28mAbs、ConA、 PMA/ionomycine刺激的小鼠T细胞增殖与PHA、PMA/ionomycine刺激的人T细胞增殖。虽然许多化合物也能够抑制T细胞增殖,但这种效应并非是免疫抑制活性而是细胞毒性引起的。因此,在对BD750进行作用机制研究前,需要明确其抑制效应是否来自细胞毒性。我们选择了三种细胞,人静息初始T细胞、IL-4处理的活化T细胞与成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes, FLS）,观察BD750的细胞毒性。人静息初始T细胞是一种不活化不增殖的T细胞。IL-4处理的活化T细胞是人初始T细胞先经抗CD3/CD28mAbs活化,72小时后洗涤再加入IL-4维持细胞活力,但此时细胞处于不增殖状态。FLS是一种非特异性增殖的细胞对照,取自需要进行关节置换手术的非关节炎患者,消化并培养、传代。FLS能在体外传10代,仍保持增殖能力。在我们的实验条件下,BD750对人静息初始T细胞（F=0.487,P=0.780,n=3）、IL-4处理的活化T细胞（F=0.717,P=0.623,n=3）与FLS（F=0.455,P=0.802,n=3）无显著细胞毒性,提示BD750选择性抑制活化的T细胞增殖。IL-2、CD25与CD69等分子是T细胞活化的标志。通过ELISA检测细胞因子产生,流式细胞术检测细胞膜分子表达,我们发现BD750不同于FK506,但与MPA、RAPA的效应一致,不抑制活化的小鼠T细胞（F=0.387,P=0.765,n=3）与人T细胞（F=0.444,P=0.728,n=3）产生IL-2以及表达CD25与CD69,提示BD750不抑制T细胞活化。细胞周期从Go/G1期进入S期是细胞增殖的前提和准备。D-type cyclins （cyclin D1、cyclin D2与cyclin D3）与周期素依赖性蛋白激酶（CDK4与CDK6）具有调节细胞周期从Go/G1期进入S期的作用。通过PI染色结合流式细胞术检测细胞周期变化以及WB检测cyclin D3与CDK6表达,我们发现BD750抑制cyclin D3与CDK6的表达,并且显著阻滞活化的小鼠T细胞周期（F=113.089,P=6.867×10-7,n=3）与人T细胞周期（F=211.245,P=5.914×10-8,n=3）于G0/Gl期。上述BD750抑制T细胞增殖的作用机制研究提示BD750作用的信号转导阶段可能在T细胞活化后到细胞周期启动前。活化的T细胞分泌的IL-2与其受体CD25结合后,通过JAK3/STAT5信号通路与PI3K/AKT-mTOR/p70S6K信号通路启动细胞周期进程与细胞增殖。为了探索BD750作用的信号通路,采用CFSE结合流式细胞术与免疫印迹技术观察BD750对IL-2诱导的CTLL-2细胞与活化的初始T细胞增殖以及STAT5、AKT与p70S6K表达与磷酸化的影响。结果发现：BD750显著抑制IL-2诱导的CTLL-2细胞与活化的人初始T细胞增殖；在IL-2诱导的活化T细胞中,BD750不抑制AKT磷酸化（F=0.317,P=0.813,n=3）以及p70S6K磷酸化（F=0.222,P=0.878,n=3）,但显著抑制STAT5磷酸化（F=104.547,P=9.324×10-7,n=3）；在IL-2诱导的CTLL-2细胞中,BD750也显著抑制STAT5磷酸化（F=168.152,P=1.452×10-7,n=3）。这些发现提示,BD750通过阻断IL-2诱导的JAK3/STAT5信号通路抑制T细胞增殖。T细胞在DTH的发病机制中占有非常重要的地位。为了明确BD750是否具有体内活性,我们采用DNFB诱导BAL b/c小鼠发生DTH反应的动物模型来观察BD750的作用。结果显示,BD750显著降低耳廓厚度（F=19.350,P=0.001,n=3）且显著减轻耳廓重量（F=13.593,P=0.002,n=3）,提示BD750可缓解DTH诱发的耳廓水肿。JAK3/STAT5信号通路在T细胞增殖分化过程中占据非常重要的地位。JAK3或STAT5基因敲除的小鼠或基因缺陷的患者均表现出重度联合免疫缺陷症（Severe combined immunodeficiency, SCID）,充分说明了JAK3/STAT5信号通路在免疫应答过程中的重要作用。另外,JAK3仅表达于白细胞,而其它器官组织细胞中均不表达JAK3。以JAK3/STAT5信号通路为靶点的药物,长期使用时将不会出现肾毒性、神经毒性、高血脂和高血压等副作用。BD750通过阻断JAK3/STAT5信号通路完全抑制T细胞增殖。因此,BD750有望成为先导化合物研发用于器官移植与多种自身免疫性疾病的新型免疫抑制剂。第3部分水溶性苯并噻唑衍生物BD926的合成与作用机制研究在T细胞介导的小鼠DTH模型中,BD750的体内活性不显著且不稳定,这将限制它的进一步研究与开发。推测主要原因是BD750难溶于水,在生理盐水中的溶解性低于0.05mg/ml。水溶性差将极大限制药物的应用,比如吸收不完全或不稳定,生物利用度低,起效慢,短时间内达不到需要的血药浓度。因此,进行结构改造,合成水溶性衍生物,是了解该类化合物体内生物学效应的关键。常见的水溶性衍生物改造方法包括：合成其丁二酸单酯、磷酸酯或硫酸酯等衍生物。但BD750特殊的烯醇互变结构,导致该羟基的酯类,特别是酸性酯难以生成,在合成过程中极易分解,难以获得。即使合成了其羧基醚类水溶性衍生物,却丧失了T细胞增殖抑制活性。另外一种常用的水溶性改造方法为合成其钠盐衍生物。经过多次实验,尝试了氢氧化钠水体系、DMF体系,均未成功。最后,在四氢呋喃体系下,获得了一种水溶性衍生物BD926。BD926在生理盐水中的溶解度超过15mg/ml,与BD750相比水溶性提高了300倍。体外与体内实验均表明,BD926具有较强的免疫抑制活性且无显著毒副作用。体外实验发现,BD926显著抑制小鼠与人T细胞增殖,且在完全抑制增殖的浓度下不影响人静息初始T细胞（F=0.314,P=0.895,n=3）、IL-4处理的活化T细胞（F=0.342,P=0.878,n=3）与FLS（F=0.251,P=0.932,n=3）的存活,提示BD926选择性抑制活化的T细胞增殖,抑制效应不是细胞毒性。不仅如此,BD926还表现出显著的体内免疫抑制效应。在DNFB诱导小鼠发生DTH的模型中,BD926剂量超过5mg/kg/d,即可显著降低耳廓厚度（F=64.185,P=6.130×10-6,n=3）且显著减轻耳廓重量（F=30.404,P=1.006×10-4,n=3）,提示BD926可缓解DTH诱发的耳廓水肿。即使BD926的剂量超过200mg/kg/d,也不会引起小鼠死亡、明显饮食行为异常与疾病表现。在IL-2诱导的T细胞中,BD926也可阻断JAK3/STAT5信号通路抑制T细胞增殖。在JAK/STAT信号通路中,传递信号的分子依次为细胞因子受体亚基、JAK与STAT。细胞因子受体亚基包括α、p、γ链与gp130等分子。JAK家族由JAK1、JAK2、JAK3与TYK2四个分子组成。参与信号转导的STAT包括STAT1-6。不同的细胞因子需要借助不同的细胞因子受体亚基、JAK与STAT向细胞内传递信号。Thl/Th2极化与Th17/Treg失衡是导致自身免疫性炎症的关键。JAK/STAT信号通路参与多种炎性细胞因子的应答,调控Th1/Th2极化并调节Th17/Treg平衡。作为潜在的JAK/STAT号通路抑制剂,细胞因子筛查显示BD926不影响IL-2（F=0.099,P=0.769,n=3）、IL-4（F=0.009,P=0.928,n=3）与IL-10（F=0.122,P=0.744,n=3）分泌,但显著抑制IFN-γ（F=645.092,P=1.427x10-5,n=3）、IL-6（F=845.594,P=8.326x10-6,n=3）与IL-17（F=256.913,P=8.859×10-5,n=3）产生。IL-12诱导CD4+T细胞分化为Thl,产生IFN-γ。IL-4诱导CD4+T细胞分化为Th2,抑制Thl分化。BD926不影响IL-4分泌,但抑制IFN-γ产生,提示BD926可能通过抑制Thl分化,调控Th1/Th2极化。IL-6是诱导CD4+T细胞分化为Th17的重要细胞因子,Th17分化增殖后可产生IL-17A、IL-17F、IL-21与IL-22等炎症细胞因子参与皮肤炎症。IL-2/TGF-β诱导CD4+CD25+T细胞分化为Treg, Treg可分泌IL-10等抗炎因子抑制炎症反应。RAPA与CP-690,550不影响IL-2分泌及CD25表达,具有促进Treg产生或保持Treg功能的效应。BD926不影响IL-2与IL-10分泌,但抑制IL-6及IL-17产生,提示BD926可能抑制Th17分化,促进Treg产生,进而调节Th17/Treg平衡。综上所述,我们合成了一组新型苯并噻唑类衍生物,其中BD750可通过阻断JAK3/STAT5信号通路,完全抑制T细胞增殖。但BD750不溶于水,导致其体内免疫抑制活性不显著且不稳定,这将限制进一步对其的研究与开发。我们随后合成BD750的水溶性衍生物BD926。它不仅体外免疫抑制活性与BD750相当,而且具有显著的体内免疫抑制活性。细胞因子筛查显示BD926不影响IL-2、IL-4与IL-10分泌,但显著抑制IFN-γ、IL-6与IL-17产生,提示BD926可能调控Th1/Th2极化并调节Th17/Treg平衡,可有效控制自身免疫性炎症。这类新型苯并噻唑类衍生物的结构完全不同于临床使用的免疫抑制剂,也不同于尚处临床试验阶段的新型化合物。按照结构生物学的原理,结构决定靶点与功能。它们可能作用于已知的信号通路和靶细胞,但也可能作用于新的靶点。因此,这类新型苯并噻唑类衍生物的发现不仅可作为分子探针探索自身免疫性疾病的发病机制,还可为发现新靶点与开发具有应用价值的新型免疫抑制剂奠定基础。
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标签：细胞增殖论文; 免疫抑制剂论文; 苯并噻唑类衍生物论文; 信号转导论文;