论文摘要
本文以膜荚黄芪幼嫩叶为外植体，研究了在黄芪愈伤组织固体培养和悬浮培养时，培养基成分、诱导子和培养条件等因素对培养物生长和次生代谢产物形成的影响，优化出适合黄芪愈伤组织和悬浮细胞培养的条件；同时还研究了细胞形态和有关生理生化指标变化。结果如下：1、黄芪叶愈伤组织诱导的最佳培养基为：MS+2,4-D(0.5mg·L-1)+6-BA(1.0mg·L-1)+NAA(2.0mg·L-1)；温度为24±1℃，黑暗培养。愈伤组织生长的最佳培养基为：MS+2,4-D(0.5mg·L-1)+6-BA(2.0mg·L-1)+NAA(2.0mg·L-1)；温度为24±1℃，黑暗培养。愈伤组织的生长周期在30～35d左右，生长曲线呈“s”型。2、黄芪愈伤组织中多糖积累的最佳培养基为：MS+2，4-D(1.0mg·L-1)+6-BA(1.0mg·L-1)+NAA(1.0mg·L-1)，其中80g·L-1蔗糖，60mmol·L-1KNO3（不加入铵盐），1.50mmol·L-1KH2PO4，1.496mmol·L-1CaCl2，培养温度为（24±1）℃，照光（1500～2000lx，时间为12h·d-1），培养后期10分钟或30分钟的紫外线照射。黄芪皂苷积累的最佳培养基：6,7-V+2,4-D(2.0mg·L-1)+6-BA(2.0mg·L-1)+NAA(1.0mg·L-1)，其中蔗糖为100g·L-1，NH+∶NO3-为1∶1(氮源总浓度为60mmol·L-1)，1.5mmol·L-1KH2PO4，8.97mmol·L-1CaCl2，24±1℃，照光；植物生长调节剂对黄芪皂苷合成的影响顺序是：2,4-D>6-BA>NAA。黄酮类物质积累的最佳培养基为:MS+2,4-D(0.5mg·L-1)+6-BA(1.0mg·L-1)，其中含有80g·L-1蔗糖，NH+∶NO3-为1∶2(氮源总浓度为60mmol·L-1)，1.5mmol·L-1KH2PO4，1.496mmol·L-1CaCl2，24±1℃，暗培养；植物生长调节剂对黄酮合成的影响顺序是：NAA>6-BA>2,4-D。在愈伤组织培养后期，紫外线照射能促进苯丙氨酸解氨酶活性升高和黄酮含量增大。3、黄芪愈伤组织固体培养中，细胞形态与次生代谢有一定的关联性，一般长形细胞数量的增加，细胞的次生代谢产物的积累也越多。植物生长调节剂对细胞次生代谢产物的影响与细胞分裂指数也有一定的关联性。4、黄芪细胞生长最佳培养基：6,7-V+2,4-D0.2mg·L-1，40g·L-1蔗糖，5.98mmol·L-1Ca2+，0.1mmol·L-1Fe盐，0.555mmol·L-1肌醇和1.249mmol·L-1KH2PO4；培养参数为：转速120rpm，温度22士1℃，暗培养。细胞生长周期约为14d。5、黄芪细胞悬浮培养生产多糖、皂苷和黄酮的培养基均采用6,7-V。其中对于多糖，培养基中添加3.0mg·L-1NAA，以及30g·L-1麦芽糖，0.555mmol·L-1肌醇和1.249mmol·L-1KH2PO4；对于皂苷，添加0.5mg·L-1的2,4-D，以及40g·L-1蔗糖，0.555mmol·L-1肌醇，1.249mmol·L-1KH2PO4，和1μmol·L-1的水杨酸、100μmol·L-1的草酸和过氧化氢的诱导子；对于黄酮，添加1.0mg·L-1的2,4-D，以及30g·L-1的麦芽糖，0.555mol·L-1肌醇，和1.294mmol·L-1KH2PO4。