纺锤体检查点及细胞周期相关基因在卵巢癌细胞对紫杉醇获得性耐药中的作用

论文摘要

研究背景卵巢癌仍然是迄今致死率最高的妇科恶性肿瘤，总的5年生存率为44％，其中晚期病例不足30％。自从90年代紫杉醇成为最主要的一线化疗药物以来，晚期卵巢癌的近期缓解率已达到80％以上，但大多数患者在2～3年内复发，几乎所有复发性卵巢癌对再次化疗耐药，化疗耐药已成为卵巢癌患者治疗失败和死亡的主要原因。紫杉醇主要通过与细胞β微管蛋白结合，促进微管聚合，使其稳定，使细胞阻滞于G2／M期，进而以P53依赖性和非依赖性途径介导细胞凋亡。目前认为肿瘤细胞对紫杉醇耐药的可能机制主要包括：P糖蛋白（P-gp）等膜转运分子表达上调导致细胞内药物浓度降低；β微管蛋白表达改变；抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调等凋亡信号途径调控异常。尽管体外研究阐明的耐药机制越来越多，但一系列针对这些可能机制而设计的临床试验的效果非常有限，提示与传统的耐药机制不同的其他分子机制可能在肿瘤细胞获得紫杉醇耐药性的过程中发挥更重要作用。近年研究表明，紫杉醇的细胞毒敏感性可能与细胞周期的纺锤体检查点（spindle checkpoint）的功能状态有关。纺锤体检查点，又称为有丝分裂纺锤体组装检查点，是细胞自身确保染色体精确分配、维持基因组稳定性的主要“质控机制”。纺锤体检查点通过生成后期促进复合体（anaphase-promoting complex／cyclosome，APC／C）的抑制分子——有丝分裂检查点复合体（mitotic checkpoint complex，MCC），阻滞细胞进入分裂后期直到所有染色体着丝点正确与微管联接。APC是一种E3泛素连接酶，活化的APC通过一系列细胞内级联反应使姐妹染色单体分离，细胞进入分裂后期，完成有丝分裂。几个高度保守的蛋白，包括：Mad1、Mad2（mitotic arrest deficient）、Bub1、Bub3（budding uninhibited benzimidazole）、BubR1（Bub1-related）和Mps1（monopolar spindle 1）是哺乳动物细胞执行纺锤体检查点功能所必需的，其中Mad2和BubR1是最重要的纺锤体检查点组分。关于纺锤体检查点与抗微管类化疗药物敏感性之间的关系是近年肿瘤化疗耐药研究的一个前沿课题，但在仅有的几个研究中结果尚存在矛盾。如Sudo发现，向乳腺癌MCF-7细胞系短暂转染Mad2或BubR1短片段干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）可使细胞纺锤体检查点功能缺失，进而抑制紫杉醇诱导的细胞死亡。但组蛋白去乙酰酶抑制剂曲古菌素A（trichostatin A，TSA）通过抑制细胞的纺锤体检查点功能却增强包括紫杉醇在内的抗微管药物的杀瘤效应。Tao等也发现，能维持长时间纺锤体检查点信号（即纺锤体检查点功能较好）的结肠癌细胞HT29更不易被紫杉醇和驱动蛋白纺锤体蛋白（kinesin spindle protein，KSP）抑制剂杀伤。因此，肿瘤细胞的纺锤体检查点功能与抗有丝分裂药物敏感性的关系需要进一步探索。另外，从本质上讲，化疗药物杀灭肿瘤细胞的机制是控制其细胞周期、抑制细胞增殖，并促进肿瘤细胞死亡。实际上包括紫杉醇在内的多数化疗药物均是细胞周期的抑制剂，因此细胞周期信号通路在肿瘤细胞产生耐药性过程中可能起重要作用。细胞周期功能基因芯片的出现为全面研究耐药肿瘤的细胞周期信号途径提供了快速、可靠的高针对性手段。本研究首先以人卵巢癌细胞系SKOV3为亲本细胞，用中等剂量间歇作用结合低剂量持续作用法诱导建立耐紫杉醇细胞模型，并观察P-gp表达和β微管蛋白亚型改变在卵巢癌细胞获得紫杉醇耐药性过程中的作用；在此基础上，着重研究耐紫杉醇细胞亚系的纺锤体检查点功能状态及其主要组分Mad2和BubR1蛋白的表达水平；最后利用功能基因芯片技术比较耐紫杉醇细胞亚系及其亲本细胞系的细胞周期调控基因表达差异，以寻找新的耐药相关基因。旨在阐明卵巢癌细胞对紫杉醇发生获得性耐药的分子机制，为克服肿瘤耐药提供新的理论依据。第一部分耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系SKOV3-TR30的建立及特征研究目的建立稳定、可靠的耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系，为紫杉醇耐药机制的研究提供实验模型；并探讨P-gp和β微管蛋白亚型在卵巢癌细胞获得紫杉醇耐药性过程中的作用。材料和方法采用中等剂量间歇作用结合低剂量持续诱导法及克隆稀释技术，从人卵巢癌细胞系SKOV3筛选建立耐紫杉醇的细胞亚系SKOV3-TR30；MTT法测定药物的细胞毒作用、计算耐药指数；HE染色和透射电镜观察细胞形态特征；流式细胞术检测SKOV3-TR30和SKOV3细胞的细胞周期分布。采用免疫细胞化学染色和实时荧光半定量RT-PCR检测SKOV3-TR30及其亲本细胞中P-gp和β微管蛋白亚型mRNA表达。结果耐药细胞亚系SKOV3-TR30对紫杉醇的耐药指数为27.5，对多西紫杉醇、托普替康、阿霉素、诺考达唑有不同程度的交叉耐药性，对卡铂无交叉耐药性。SKOV3-TR30细胞的体积较大，多核更明显，胞浆中细胞器也更丰富。紫杉醇作用后，SKOV3细胞生长明显受限，出现细胞数减少、细胞水肿变圆、漂起死亡；而SKOV3-TR30细胞则无明显损伤性表现。SKOV3-TR30增殖的倍增时间为27.1±1.2 h，速度较SKOV3（21.4±1.5 h）减慢。与SKOV3细胞相比，SKOV3-TR30细胞G0／G1期比率显著下降（54.8％±6.3％vs 72.7％±7.6％，P=0.035），G2／M期比率显著增加（24.9％±6.0％vs 10.2％±3.5％，P=0.021），而S期细胞比率两者无显著差异。SKOV3-TR30和SKOV3细胞的P-gp免疫化学染色积分分别为5.7±0.6和5.3±0.6，两者无显著性差异（P=0.519）。与SKOV3细胞相比，SKOV3-TR30细胞βⅠ、βⅡ、βⅢ、βⅣb四种微管蛋白亚型mRNA表达水平升高，而βⅣa亚型表达降低，但只有βⅠ和βⅡ亚型的表达升高具有统计学意义（P＜0.05）。结论1．成功建立了耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系SKOV3-TR30，为研究卵巢癌发生紫杉醇获得性耐药的机制、寻找逆转耐药的新方法提供了可靠的体外实验模型。2．P-gp在SKOV3-TR30获得紫杉醇耐药性过程中不起重要作用，但β微管蛋白亚型表达改变可能与卵巢癌紫杉醇获得性耐药有关。第二部分SKOV3-TR30细胞纺锤体检查点功能及Mad2、BubR1蛋白表达研究目的检测耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系SKOV3-TR30的纺锤体检查点功能状态及其主要组分Mad2和BubR1蛋白的表达水平，以探讨卵巢癌细胞的纺锤体检查点功能与紫杉醇获得性耐药的关系。材料和方法采用Hoechest33258染色法计数有丝分裂指数，流式细胞术分析细胞周期分布，染色体分离实验计数姐妹染色单体提前分离的细胞比例，western blot和免疫细胞化学测定相关蛋白表达。结果1．细胞经100 nM紫杉醇作用24小时后，63.4％的SKOV3停滞在有丝分裂中期（有丝分裂指数为63.4％）；而仅有22.7％的SKOV3-TR30停滞在有丝分裂中期（有丝分裂指数为22.7％）。经50 nM诺考达唑作用24小时后，53.5％的SKOV3细胞停滞在有丝分裂中期（有丝分裂指数为53.5％）；而仅有22.1％的SKOV3-TR30停滞在有丝分裂中期（有丝分裂指数为22.1％）。2．流式细胞检测显示，纺锤体检查点激活剂（100 nM紫杉醇，50 nM诺考达唑）作用24小时后，绝大部分（80％）SKOV3细胞被阻滞在G2-M期，相反，只有小部分（30％）SKOV3-TR30细胞被阻滞在G2-M期。3．100 nM紫杉醇或50 nM诺考达唑作用5小时后，分别有4.7％和5.3％的SKOV3细胞出现姐妹染色单体分离，而SKOV3-TR30细胞则分别有30.5％和26.8％出现姐妹染色单体分离，提早进入分裂后期。4．蛋白免疫印迹显示，100 nM紫杉醇处理24小时后，SKOV3-TR30细胞中securin和cyclin B1的表达水平显著低于SKOV3细胞，以内参照β-actin标准化后其表达水平分别为14.9％±11.3％vs 75.0％±14.1％，12.4％±2.1％vs 24.1％±5.8％。而细胞经50 nM诺考达唑作用24小时后，SKOV3-TR30细胞中securin和cyclin B1的表达水平也显著低于SKOV3细胞，分别为0.9％±1.5％vs 78.1％±23.5％，11.7％±4.2％vs29.3％±8.4％。5．蛋白免疫印迹发现，SKOV3-TR30细胞中Mad2蛋白相对表达水平为26.3％±6.3％，而SKOV3细胞Mad2蛋白相对表达水平为29.3％±3.7％，两者无显著性差异。细胞免疫化学染色也显示SKOV3-TR30和SKOV3细胞中Mad2蛋白表达水平无显著性差异。SKOV3-TR30细胞中BubR1表达水平显著低于SKOV3细胞（22.6％±10.2％vs76.4％±9.1％，P＜0.01）。细胞免疫化学染色结果也支持SKOV3-TR30细胞的BubR1表达水平显著低于SKOV3细胞（immunostaining score，2.3±0.6 vs 6±0，P＜0.01）。6．SKOV3-TR30和SKOV3细胞经30 nM紫杉醇作用24小时后BubR1的表达水平都显著增高。结论耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系SKOV3-TR30的纺锤体检查点功能存在部分缺失或减弱，由BubR1蛋白表达下调所致的纺锤体检查点功能减弱可能是卵巢癌细胞对紫杉醇发生获得性耐药的机制之一。第三部分细胞周期相关基因在SKOV3-TR30细胞中的表达变化研究目的比较耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系SKOV3-TR30与其亲本细胞系SKOV3的细胞周期相关基因表达谱的差异，以寻找卵巢癌新的耐药相关基因。材料和方法用包含283个细胞周期相关基因的功能芯片检测SKOV3-TR30和SKOV3细胞mRNA表达谱，通过ImaGene软件对扫描图像进行对比分析，筛选2种细胞中有表达差异的细胞周期相关基因；采用实时荧光半定量RT-PCR及western blot验证差异表达基因。结果发现表达差异2倍以上的细胞周期相关基因共41个，其中耐药细胞表达上调的基因6个，表达下调的基因35个；差异5倍以上的基因3个，分别为CCNA1（NM003914）、GRB10（NM005311）和GSK-3α（NM019884）。GSK-3α实时荧光PCRΔCt值：SKOV3-TR30细胞显著低于SKOV3细胞（7.85±0.30 vs 10.96±1.00，P=0.007），提示耐药细胞中GSK-3αmRNA表达水平显著高于敏感细胞，与芯片结果一致。而GRB10实时荧光PCRΔCt值：SKOV3-TR30细胞略高于SKOV3细胞（9.85±0.56 vs 9.07±0.84，P=0.251），说明耐药细胞中GRB10 mRNA表达水平较亲本细胞有下降，与芯片结果趋势一致，但差异无统计学意义。耐药细胞SKOV3-TR30中GSK-3蛋白的表达水平显著高于敏感细胞SKOV3，相对表达量分别为172.2±36.2和52.3±14.4（以β-actin为内参照，P=0.006）。耐药细胞及其亲本细胞都以表达GSK-3β蛋白为主，其中SKOV3细胞中GSK-3α蛋白表达量极少。SKOV3-TR30细胞中GSK-3α和GSK-3β蛋白的表达水平都显著高于SKOV3，分别为71.7±20.9vs 19.4±13.8，P=0.022：127.1±13.9 vs 51.0±9.0，P=0.001。结论耐紫杉醇卵巢癌细胞亚系有多个细胞周期相关基因表达异常，其中GSK-3表达上调可能是卵巢癌细胞对紫杉醇发生获得性耐药的新机制。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文
• 前言
• 第一部分
• 第二部分
• 第三部分
• 结论
• 综述一
• 综述二
• 附录
• 致谢