呋喃二烯通过激活TNFR1信号途径诱导人白血病HL60细胞凋亡

论文摘要

呋喃二烯是从姜黄属植物温郁金中分离出来的一种天然化合物。文献报道呋喃二烯可诱导人肝癌HepG2细胞周期阻滞于G2/M期而抑制细胞增殖,并可通过线粒体途径诱导细胞凋亡。本文应用人白血病HL60细胞株为模型,考察了呋喃二烯体外对HL60细胞的增殖抑制作用及其精确分子机制。采用台盼蓝排斥法考察了呋喃二烯对HL60的增殖抑制作用,结果表明,呋喃二烯在10-70μM浓度范围可抑制HL60增殖,并呈时间及浓度依赖性,作用72h的IC50值为32.7μM。通过流式细胞术,AO/EB双染法和DNA琼脂糖凝胶电泳法对呋喃二烯的凋亡诱导作用进行了考察:流式细胞术结果可见呋喃二烯处置组可使SubG1期细胞的比率明显增加,而G0/G1期、S期和G2/M期细胞比率无明显变化;AO/EB双染法实验中,呋喃二烯处置细胞在荧光显微镜下可见细胞凋亡形态学特征,细胞凋亡计数结果可见凋亡细胞的比率呈浓度依赖性增加;DNA琼脂糖凝胶电泳实验中呋喃二烯处置组可见明显的DNA梯状条带。以上结果表明,呋喃二烯可诱导HL60细胞凋亡。Caspases蛋白在凋亡过程中起着非常重要的作用,为了确认呋喃二烯诱导HL60细胞凋亡的分子机制,我们采用免疫印迹技术首先对细胞内Caspases的活性进行了检测,呋喃二烯可裂解活化caspase-3、caspase-8、caspase-9及caspase-3的底物PARP,表明呋喃二烯诱导HL60细胞凋亡是通过激活Caspases途径而实现,在对Bcl-2家族蛋白的检测中,我们发现呋喃二烯可裂解caspase-8底物Bid蛋白,而对Bcl-2家族的其他成员如Bcl-2,Bax和Bcl-xL的表达无明显影响;Bid蛋白作为caspase-8的底物,在内源性和外源性凋亡途径中起着桥梁作用,因而我们认为呋哺二烯诱导的caspase-3的激活是由外源性和内源性两条凋亡途径通路实现,其中内源性凋亡途径中caspase-9的活化继发于caspase-8信号中Bid的活化。通常认为caspase-8是通过死亡受体途径激活,因而我们对其上游的死亡受体表达情况进行了考察,结果表明,呋喃二烯可使TNFR1蛋白的表达明显上调,而对死亡受体4/5和Fas的表达没有明显影响。我们采用ELISA法对培养基中的TNFR1配体TNFα的水平进行了考察,结果表明呋喃二烯作用3小时后,培养基中的TNFα水平有明显升高,在6小时达到最大值。以上结果表明,呋喃二烯诱导HL60细胞凋亡可能通过激活TNFR1信号途径而产生。为确认TNFR1信号途径的激活,采用免疫沉淀的方法对TNFR1复合物进行了考察,结果可见,呋喃二烯作用6h后复合物中TRAF2和RIP的表达均有明显上调,表明呋哺二烯可促进TNFR1复合物的形成,进而激活caspase-8而启动凋亡信号。作用后形成了复合物,这也进一步确认了呋喃二烯诱导的HL60细胞凋亡是特异的通过TNFR1信号通路介导的。为进一步确认TNFR1信号通路在呋喃二烯诱导的HL60细胞凋亡中的作用,我们考察了可溶性的TNFR1受体（TNFR1-Fc Chimera）对呋喃二烯诱导HL60细胞凋亡的影响,结果表明,TNFR1-Fc蛋白可明显抑制呋喃二烯诱导的HL60细胞凋亡,这个结果也进一步确认了呋喃二烯诱导HL60细胞凋亡是通过激活TNFR1信号所介导。活性氧在多种抗肿瘤药物诱导凋亡过程中起着介导和调节作用,我们采用流式细胞术对呋喃二烯处置的HL60细胞内活性氧水平进行了考察,结果表明,呋喃二烯对细胞内的活性氧水平无明显影响。此外,两种抗氧化剂过氧化氢酶（CAT）和N-乙酰半胱氨酸（NAC）对呋喃二烯诱导HL60细胞凋亡及Caspases的活化也无明显影响。以上结果表明,呋喃二烯诱导HL60细胞凋亡不依赖于活性氧的产生。综上所述,呋喃二烯对HL60细胞的增殖抑制作用是通过诱导细胞凋亡实现的,呋喃二烯诱导的HL60细胞凋亡是通过激活TNFR1信号途径而产生。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1.1 白血病
• 1.2 细胞凋亡
• 1.2.1 凋亡的发现及其特征
• 1.2.2 细胞凋亡的信号转导途径
• 1.3 立题依据、目的及意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞株及细胞培养
• 2.1.2 药品及主要试剂
• 2.1.3 药品及试剂配制
• 2.1.4 主要仪器与设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 台盼蓝排斥法考察化合物的细胞生长抑制作用和细胞毒作用
• 2.2.2 AO-EB荧光双染法检测细胞凋亡
• 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.4 免疫印迹技术检测蛋白表达
• 2.2.5 流式细胞术检测细胞周期分布
• 2.2.6 流式细胞术检测活性氧蓄积
• 2.2.7 免疫共沉淀试验检测TNFR1复合物的生成
• 2.2.8 TNFα检测
• 第三章 实验结果
• 3.1 呋喃二烯对HL60细胞株的生长抑制作用
• 3.2 流式细胞术检测呋喃二烯对HL60细胞株周期分布的影响
• 3.3 AO/EB双染法检测呋喃二烯诱导HL60细胞凋亡
• 3.4 DNA凝胶电泳检测呋喃二烯诱导HL60细胞凋亡
• 3.5 呋喃二烯对caspase蛋白活性的影响
• 3.6 呋喃二烯对Bcl-2家族蛋白活性的影响
• 3.7 呋喃二烯对细胞内死亡受体表达的影响
• 3.8 呋喃二烯可明显上调培养基中TNFα水平
• 3.9 TNFa-TNFR1结合后细胞内复合物的形成
• 3.10 可溶性的TNFR1受体可阻断呋喃二烯诱导的细胞凋亡
• 3.11 呋喃二烯对HL60细胞内活性氧水平的影响
• 3.12 抗氧化剂对呋喃二烯凋亡诱导作用的逆转情况
• 3.13 呋喃二烯对K562和Jurkat细胞株的作用
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 发表文章目录
• 致谢