盾壳霉产黑色素形成相关基因CmPKS1的克隆及其功能验证

论文摘要

盾壳霉（Coniothyrium minitans）是核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的重寄生菌,是一种重要的生防菌。本文以从盾壳霉ZS-1菌株T-DNA标记插入突变体库中筛选到的产黑色素缺陷型突变体ZS-1TN25878菌株为材料,克隆到产黑色素相关的基因,并对该基因进行功能验证,结果如下：在PDA培养基上,突变体ZS-1TN25878的菌丝出现白化现象,丧失产生黑色素的能力,菌丝生长速度、生物学产量和产孢与出发菌株ZS-1无显著差别,寄生致腐菌核的能力显著差别。为了明确该突变体中被插入破坏基因的功能,通过反向PCR扩增出了500bp的DNA序列,根据该序列在盾壳霉基因组中进行比对,发现该基因全长为6708bp,含有2个内含子,编码2161aa, T-DNA标记插入该基因3’末端,距离终止密码子481bp处。对推定的氨基酸序列进行功能预测,发现该序列中含有保守区域,即KS、AT、ACP、TE域。该氨基酸序列与其他真菌的酮体合成酶具有高度的同源性,故命名该基因为CmPKSl。RT-PCR结果表明CmPKSl基因在ZS-1TN25878中不表达,在菌株ZS-1中表达。构建了CmPKSl基因敲除载体,利用农杆菌介导转化的方法转化ZS-1菌株,获得了1个CmPKSl基因敲除转化子PKS2-12,CmPKSl基因敲除转化子与出发菌株ZS-1相比,出现白化现象,表现出与突变体ZS-1TN25878一致的性状。证实CmPKSl与盾壳霉的黑色素形成相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 核盘菌的研究进展
• 1.1 核盘菌及其危害
• 1.2 核盘菌的生物学、生态学特性
• 1.3 作物菌核病的防治
• 2 盾壳霉的研究进展
• 2.1 盾壳霉的生物学特性
• 2.2 盾壳霉的生态学特征
• 2.3 盾壳霉的分子生物学研究进展
• 3 与黑色素形成相关的聚酮合成酶研究进展
• 3.1 聚酮合成酶研究进展
• 4
• 4.1 农杆菌介导的真菌遗传转化研究
• 5 基因功能的研究方法
• 6 本项研究的意义
• 第二章 盾壳霉产黑色素缺陷型突变体ZS-1TN25878菌株的基本生物学性状的测定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 突变体菌株ZS-1TN25878的形态特征观察
• 1.2.2 突变体菌株ZS-1TN25878菌丝生长速度的测定
• 1.2.3 突变体菌株ZS-1TN25878的生物产量测定
• 1.2.4 突变体菌株ZS-1TN25878菌丝及孢子产生抗真菌物质能力测定
• 1.2.5 ZS-1TN25878在PDA上产抗细菌物质能力测定
• 1.2.6 ZS-1TN25878寄生致腐核盘菌菌核能力的测定
• 1.2.7 数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 突变体ZS-1TN25878菌株的形态特征观察
• 2.2 突变体ZS-1TN25878及菌株ZS-1的菌丝生长速度
• 2.3 突变体ZS-1TN25878的生物产量
• 2.4 突变体ZS-1TN25878不具产生抗真菌物质的能力
• 2.5 突变体ZS-1TN25878产抗细菌物质的能力
• 2.6 突变体ZS-1TN25878寄生致腐菌核能力
• 3 结论和讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 第三章 盾壳霉黑色素相关基因的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基、载体、抗生素及引物
• 1.1.3 质粒抽提溶液配制
• 1.1.4 其它所用溶液及试剂
• 1.1.5 限制性内切酶及其它酶、试剂盒及其它试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌丝培养
• 1.2.2 基因组DNA的提取
• 1.2.3 反向PCR
• 1.2.4 目的片段的回收及纯化
• 1.2.5 回收产物与克隆载体连接
• 1.2.6 大肠杆菌感受态细胞转化连接产物
• 1.2.7 重组质粒的提取及鉴定
• 1.2.7.1 重组质粒的提取
• 1.2.7.2 重组质粒的鉴定
• 1.2.8 克隆序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 CmPKS1全长序列的获得
• 2.2 CmPKS1全长序列分析
• 3 结论和讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 第四章 盾壳霉CMPKS1功能的验证
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株、抗生素、载体、及引物
• 1.1.2 试验试剂及培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 RT-PCR验证ZS-1TN25878中CmPKS1基因的表达
• 1.2.2 盾壳霉CmPKS1敲除载体的构建
• 1.2.3 重组质粒农杆菌的获取
• 1.2.3.1 农杆菌感受态的制备及热击转化
• 1.2.3.2 农杆菌重组质粒的酶切鉴定
• 1.2.4 农杆菌介导转化盾壳霉ZS-1菌株
• 1.2.5 盾壳霉CmPKS1敲除转化子的PCR鉴定
• 1.2.5.1 提取转化子基因组DNA
• 1.2.5.2 转化子PCR扩增
• 1.2.6 盾壳霉CmPKS1敲除转化子基本生物学性状的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 ZS-1TN25878中PKS基因不表达
• 2.2 盾壳霉CmPKS1敲除载体的构建及鉴定
• 2.3 含重组质粒农杆菌的鉴定
• 2.4 农杆菌介导介导转化盾壳霉ZS-1菌株
• 2.5 盾壳霉CmPKS1敲除转化子PCR鉴定结果
• 2.6 盾壳霉CmPKS1敲除转化子基本生物学性状的测定
• 2.6.1 敲除转化子形态特征的观察
• 2.6.2 敲除转化子生长速度的测定
• 2.6.3 敲除转化子在PDA上产抗真菌物质能力的测定
• 3 结论和讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢