甘肃棘豆内生细菌中苦马豆素降解菌的筛选与鉴定

论文摘要

疯草是豆科棘豆属和黄芪属有毒植物的总称,是世界范围内危害草原畜牧业最严重的有毒植物之一。疯草的主要毒性成分是苦马豆素,其主要毒性作用是抑制细胞中α-甘露糖苷酶活性,影响糖蛋白的代谢,导致细胞空泡变性,致使动物中毒死亡。甘肃棘豆作为疯草中的一种,广泛分布于四川和甘肃等草场,对牧区畜牧业造成严重危害。研究表明,疯草作为一种豆科植物,含有丰富的营养成分和矿物元素,如能将其合理的开发利用,不仅能控制疯草中毒,也能一定程度的解决饲草短缺问题。王妍等从疯草埋置土壤中筛选出一株具有高效降解苦马豆素能力的细菌,余永涛等从甘肃棘豆中筛选出了能产生苦马豆素的内生真菌。本试验以甘肃棘豆为例,筛选其内生细菌中的苦马豆素降解菌,并对所筛选到的苦马豆素降解菌进行鉴定。本试验的开展也为疯草内生细菌与苦马豆素关系的研究奠定基础。1.测定川西北牧区甘肃棘豆样品中苦马豆素含量将甘肃棘豆样品风干粉碎后,以75%乙醇作为提取剂,采用索氏提取法对其苦马豆素进行浸提,以气相色谱法检测其中苦马豆素的含量,测得样品中苦马豆素含量为65.405μg/g。本试验证明所采四川省川西北高原牧场甘肃棘豆属于疯草的一种,为疯草内生细菌的分离提供菌源。2.甘肃棘豆中内生细菌的分离培养取新鲜、表面无病斑的健康甘肃棘豆植株,用70%乙醇和次氯酸钠进行表面消毒；将表面消毒后的植株样品剪短、研碎,吸取研磨液于普通肉汤中进行增菌培养,48 h后涂布于固体培养基表面,进行内生细菌的分离培养。通过细菌形态学观察,从甘肃棘豆中初步分离出83株内生细菌。本试验对甘肃棘豆中内生细菌进行了初步分离、培养,为筛选疯草内生细菌中苦马豆素降解菌奠定基础。3.内生细菌中苦马豆素降解菌的筛选与降解能力测定通过富集培养,从甘肃棘豆内生细菌中筛选出5株菌株能在以苦马豆素为唯一碳源的无机盐固体培养基中生长。经3次重复试验,气相色谱法检测,其中仅有一株内生菌（编号为Ab）具有稳定降解苦马豆素能力,在24 h内,对浓度100 mg/L的苦马豆素降解率为11.5771%。延长培养时间并不能提高其降解苦马豆素的能力,但可耐受高质量浓度（1 g/L）的苦马豆素。4.苦马豆素降解菌的鉴定根据细菌形态学观察、生理生化检测和16SrDNA序列测定与分析,以及基于16SrDNA序列的系统发育分析等方法对降解菌进行鉴定。结果表明,菌株Ab为革兰氏阴性短小杆菌,最接近柄杆菌科（Caulobacteraceae）短波单胞菌属（Brevundimonas）的缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta）,最终命名为Brevundimonas diminuta Ab,其16S rDNA序列已上传至GeneBank,登录号为HM625914。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 第一章 疯草研究进展
• 1.1 疯草的种类及生态分布
• 1.1.1 疯草的种类
• 1.1.2 疯草的生态分布
• 1.2 疯草中毒及毒性成分
• 1.2.1 疯草的中毒
• 1.2.2 疯草的主要毒性成分
• 1.3 疯草的危害
• 1.3.1 加剧草场退化,破坏草地生态平衡
• 1.3.2 引起家畜中毒死亡
• 1.3.3 导致家畜繁殖障碍
• 1.4 疯草的防除
• 第二章 苦马豆素研究进展
• 2.1 苦马豆素的理化性质
• 2.2 苦马豆素的来源
• 2.3 苦马豆素的提取方法
• 2.4 苦马豆素的抗肿瘤研究
• 第三章 内生菌研究进展
• 3.1 内生菌种类及分布
• 3.2 内生菌的次生代谢物
• 3.2.1 抗肿瘤活性物质
• 3.2.2 抗菌物质
• 3.2.3 杀虫活性物质
• 3.3 疯草内生菌
• 第二部分 本实验研究目的和意义
• 第三部分 试验研究部分
• 第四章 甘肃棘豆中苦马豆素的提取及含量测定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 标准曲线制作
• 4.2.2 试样的气相检测
• 4.3 讨论
• 4.3.1 甘肃棘豆中苦马豆素含量测定
• 4.3.2 苦马豆素的检测方法
• 4.4 小结
• 第五章 甘肃棘豆内生细菌的分离及初步鉴定
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 植物表面消毒及内生细菌分离
• 5.3.2 内生细菌多样性研究
• 5.4 小结
• 第六章 甘肃棘豆内生细菌中苦马豆素降解菌的筛选
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 试验材料
• 6.1.2 试验方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 菌株的初筛
• 6.2.2 菌株的复筛及降解能力检测
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 第七章 苦马豆素降解菌的鉴定
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 试验材料
• 7.1.2 试验方法
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 形态学特征观察
• 7.2.2 生理生化特征
• 7.2.3 菌株的16SrDNA的序列测定与系统发育分析
• 7.3 讨论
• 7.4 小结
• 第四部分 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文目录