论文摘要
恶性肿瘤严重威胁着人类健康,过继转输治疗是继手术、放化疗三大常规治疗后最具应用前景的治疗手段之一。最近,一种新型的基因修饰T细胞技术被用于过继转输治疗,即通过免疫受体修饰T细胞,使T细胞拥有肿瘤抗原特异性,进而转输体内发挥抗肿瘤效应。常见的策略分为两种：抗原特异性异二聚体TCR和嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor, CAR）。近年来,越来越多针对特异性肿瘤抗原的CAR被成功构建,部分已进入临床实验阶段。相应的临床实验结果显示,在多种肿瘤中,分离病人自体淋巴细胞,体外利用基因工程技术使其表达肿瘤抗原特异性CAR分子,再转输病人体内,可有效抑制肿瘤生长,延长患者生存时间。但是同时也发现,抗原特异性T细胞在患者体内会受到负性调控,使其抗肿瘤效应丧失或被削弱,有研究者分离肿瘤浸润T淋巴细胞体外培养后,其抗肿瘤效应又会恢复,提示患者体内存在免疫抑制性环境,阻止抗原特异性T细胞发挥抗肿瘤效应。经研究发现,体内的这个免疫抑制性环境主要来自肿瘤微环境,在肿瘤微环境中存在大量免疫抑制性分子和细胞,可通过多种机制部分或完全抑制肿瘤特异性T细胞的增殖活化和发挥抗肿瘤效应,进而使肿瘤无法被完全清除,因此抗原特异性T细胞转输治疗的效果被显著削弱。PD-1/PDL1负性信号在肿瘤微环境中发挥着关键作用,成为多种肿瘤预后差的重要指标。PD-1/PDL1相互作用不但能阻断T细胞活化第一、二信号,阻止效应性T细胞活化增殖,发挥抗肿瘤效应,而且还能辅助调节性T细胞发挥抑制性功能,甚至诱导辅助性T细胞向调节性T细胞转化。而在肿瘤微环境中,CD28和41BB等诱导正性信号的共刺激分子通常是缺失表达的。那么,通过构建嵌合转换受体是否可以既阻断PD-1/PDL1负性信号,又同时诱导CD28和41BB等正性信号?嵌合转换受体是否能以分泌型的方式表达,以增加其作用范围和转换效率?嵌合转换受体是否可以阻断PD-1/PDL1负性信号对天然调节性T细胞的辅助作用和对诱导调节性T细胞的诱导作用?本文旨在阐明这些科学问题。有鉴于此,本研究拟构建膜结合型和分泌型两种PD-1/PDL1信号转换嵌合受体,联合CAR转染正常人外周血T淋巴细胞,对比两种信号转换受体对PD-1/PDL1负性信号的抵抗作用,以及对CAR+T细胞功能发挥的辅助作用。接着,研究两种信号转换受体对天然调节性T细胞抑制作用的抵抗能力。进一步,建立三种调节性T细胞体外诱导模型,探讨两种信号转换受体对调节性T细胞诱导过程的阻断能力,以期能解除CAR+T细胞在过继转输患者体内遇到的负性调控,为寻求基于CAR的过继转输免疫生物治疗的最佳方案提供新策略。第一部分膜结合型PD-1/PDL1信号转换嵌合受体的表达和作用在肿瘤微环境中,存在负性因子、细胞大量聚集和共刺激分子广泛缺失的现象,从而有效抑制效应性T细胞增殖活化,发挥抗肿瘤效应。研究发现,构建小鼠的CTLA4-CD28信号转换受体,通过逆转录病毒转染T细胞可显著上调IFN-y和IL-2的分泌水平,并有效抑制体内肿瘤生长。还有研究发现,构建人的膜结合型PD1-CD28信号转换受体,慢病毒转染人的外周血CD8+T细胞,同样上调Erk磷酸化水平,促进细胞因子分泌,增强细胞增殖能力。据此,我们首先构建了人的膜结合型PD1-CD28和PD1-41BB信号转换受体质粒,考虑RNA比病毒载体更为安全可控,我们将其制成相应的RNA,与抗CD19zCAR RNA以电转的方式共转入正常人外周血T淋巴细胞,16小时后流式检测信号转换受体和CAR分子在T细胞表面的表达情况。结果发现,信号转换受体和CAR分子均可高表达于T细胞表面。接着,将T细胞与K562、K562-CD19和K562-CD19-PDL1肿瘤细胞按1：4共孵育4小时后检测CD8+T细胞表面CD107a分子的表达水平。结果发现,PD1-CD28和PD1-41BB信号转换受体可有效抵抗PD1/PDL1负性信号引起的CD107a分子下调。进一步,将T细胞与K562、K562-CD19、 K562-CD19-PDL、 K562-meso-PDL1、Nalm6、Nalm6-PDL1肿瘤细胞按1：1共孵育16小时,收集细胞培养上清,利用ELISA检测IL-2和IFN-γ的分泌水平。结果发现,PD1-CD28和PD1-41BB信号转换受体在PD1/PDL1负性信号存在的情况下,仍可诱导较高IL-2和IFN-γ细胞因子的分泌水平,并且这一效应依赖特异性肿瘤抗原的存在。本部分研究结果表明,膜结合型PD1-CD28和PD1-41BB信号转换受体可高水平表达于人T细胞表面,并具有阻断PD-1/PDL1负性信号和诱导CD28、41BB正性信号的能力。第二部分分泌型PD-1/PDL1信号转换嵌合受体的表达和作用双特异性T细胞衔接子（Bispecific T cell engager, BiTE）是利用单链双特异性抗体技术将两种单克隆抗体连接起来的具有双特异性的抗体组分,可将同一或不同细胞上两种抗原表位特异性连接起来,进而发挥相应的作用。研究发现,将αCD3与αCD19单克隆抗体制成的BiTE,可同时结合T细胞表面的CD3分子和肿瘤细胞表面的CD19分子,不但拉近效应性T细胞和肿瘤细胞之间的距离,而且还激活T细胞的TCR信号,促其增殖活化和对肿瘤细胞的杀伤作用。因此我们考虑,若将αPDL1与αCD28单克隆抗体制成BiTE,是否可以在拉近效应性T细胞和肿瘤细胞之间距离的同时,进一步实现将肿瘤给予的负性信号转换为正性信号,刺激T细胞活化增殖?据此,我们选择了3个抗人PDL1单克隆抗体：10A5、13G4和1812,和抗人CD28超抗体1412,构建了3种分泌型αPDL1-aCD28信号转换受体质粒：pGEM-10A5-1412、pGEM-13G4-1412和pGEM-1B12-1412。同样制备成RNA,与抗CD19z CAR RNA以电转的方式共转入正常人外周血T淋巴细胞,4小时和16小时后分别流式检测信号转换受体结合T细胞表面CD28分子的能力,同时在转化后16小时收集细胞上清,标记K562-CD19-PDL1和K562-CD19肿瘤细胞,30分钟后流式检测转换受体结合肿瘤细胞表面PDL1分子的能力。结果发现,信号转换受体同时具有结合T细胞表面CD28分子和肿瘤细胞表面PDL1分子的能力。接着,将T细胞与K562、K562-CD19和K562-CD19-PDL1肿瘤细胞按1：4共孵育4小时后检测CD8+T细胞表面CD107a分子的表达水平。结果发现,10A5-1412和13G4-1412信号转换受体可有效抵抗PD1/PDL1负性信号引起的CD107a分子下调。进一步,将T细胞与K562、K562-CD19和K562-CD19-PDL1肿瘤细胞按1：1共孵育16小时,收集细胞培养上清,利用ELISA检测II--2和IFN-γ的分泌水平。结果发现,13G4-1412信号转换受体在PD1/PDL1负性信号存在的情况下,仍可诱导较高IL-2细胞因子的分泌水平。同时还发现,与K562-CD19共孵育时,10A5-1412和13G4-1412信号转换受体即可诱导较高水平IL-2,利用抗体分别或同时阻断肿瘤细胞和T细胞表面PDL1分子表达,II-2分泌水平都被明显下调。本部分研究结果表明,分泌型信号转换受体具有结合T细胞和肿瘤细胞的能力,并具有阻断PD-1/PDL1负性信号和诱导CD28正性信号的能力。同时分泌型信号转换受体识别低水平PDL1分子表达,提示其作用相较于膜结合型信号转换受体更为敏感。第三部分PD-1/PDL1信号转换嵌合受体对调节性T细胞的调控作用在肿瘤微环境中,调节性T细胞通过多种方式抑制过继转输的CAR+T细胞发挥抗肿瘤效应,成为基于CAR的过继转输免疫生物治疗的一大障碍。近年来已有文献报道,在前列腺癌局部,PD-1分子可以辅助调节性T细胞的抑制功能,同时还能诱导辅助性T细胞向调节性T细胞转化。且已有研究表明,阻断PD-1/PDL1信号可削弱调节性T细胞对效应性T细胞增殖活化及抗肿瘤相关细胞因子分泌的抑制,进而促进效应性T细胞抗肿瘤效应的充分发挥。那么,既然我们的信号转换受体同样具有阻断PD-1/PDL1信号的能力,是否也具有抵抗调节性T细胞增殖抑制、阻断调节性T细胞诱导的能力呢?因此,我们首先分选了具有免疫抑制功能的正常人外周血CD4+CD25+T细胞,即天然型调节性T细胞。将膜结合型和分泌型信号转导受体RNA与抗Her2/neu CAR RNA以电转的方式共转入标记了CFSE的正常人外周血CD4+CD25-T细胞,以灭活的K562-her2/neu肿瘤细胞刺激活化,同时按不同比例加入CD4+CD25+T细胞抑制其增殖。分别在共孵育6天和8天后,流式检测各组CD4+CD25-T细胞增殖情况。结果发现,膜结合型和分泌型信号转导受体均可有效抵抗天然调节性T细胞的增殖抑制。进一步,为了研究信号转导受体是否可以阻断诱导型调节性T细胞的诱导过程。我们首先建立了三种不同的调节性T细胞体外诱导系统,将Naive T细胞诱导成具有免疫抑制功能的调节性T细胞。接着,我们将膜结合型和分泌型信号转导受体RNA电转入Naive T细胞,然后利用三种体外诱导系统诱导调节性T细胞。经5天体外诱导后,检测信号转导受体对调节性T细胞诱导过程的影响。结果发现,分泌型信号转导受体10A5-1412可部分阻断其中一种诱导系统对调节性T细胞的诱导。综上所述,我们成功构建了膜结合型PD1/PDL1信号转换受体PD1-CD28、 PD1-41BB,同时首次利用BiTE技术构建了分泌型PD1/PDL1信号转换受体10A5-1412、13G4-1412、1B12-1412。在CAR提供了第一信号时,PD1/PDL1信号转换受体无论是膜结合型还是分泌型均可有效阻断PD1/PDL1负性信号,同时诱导CD28或41BB正性信号,实现了负性信号向正性信号转换,进而抵抗天然调节性T细胞的增殖抑制。此外,分泌型PD1/PDL1信号转换受体还可以部分抵抗调节性丁细胞的诱导过程。该研究为优化基于CAR的过继转输免疫生物治疗提供了新方案,具有很强的临床应用价值。