人类未知基因MGC13096的鉴定与功能研究

论文摘要

MGC13096是一功能完全未知的假设蛋白，它包含了一个PDCD2C结构域。这个结构域同时也存在于PDCD2（Programmed cell death 2）蛋白中。GO（Gene ontology，基因功能分类体系）认为PDCD2和MGC13096都具有凋亡调节活性，参与凋亡过程。有文献对PDCD2是个凋亡相关蛋白提出了置疑。 通过对PDCD2的生物信息学分析表明：PDCD2在胸腺、淋巴结高表达；上游非翻译区有Elk-1，HEN1，HIC-1，HES-1，AP4，CDE／CHR等分化、增殖相关的转录因子结合；在生长、分化、感染类的基因表达谱中有较多的显著差异。而MGC13096则在结肠、肺、子宫颈、胃、肠等高表达；只发现在胰岛素抗性病人的基因表达谱中表达显著加强。 序列研究表明：在HEK293T、胃癌AGS细胞中PDCD2的两个转录本编码区与Genbank中的序列（NM002598、NM144781）相比均少了一段99bp的序列，Genbank接收号为：AY948416、AY948417。测序证实HEK239T、肝癌HepG2细胞中MGC13096的编码区序列与Genbank中的编码区序列（NM032346）完全一致。 用无血清、2％乙醇、4％乙醇、4％DMSO、8％DMSO等刺激HEK293T细胞发生凋亡的情况下，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，用荧光定量PCR方法分析MGC13096、PDCD2的基因表达情况，。无血清、2％乙醇刺激下DNA发生泄漏的凋亡细胞数没有显著变化，其

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 本文的创新点
• 第一部分 研究目的和设计思路
• 1.1 研究目的
• 1.2 设计思路
• 1.3 技术路线框架
• 第二部分 文献综述
• 2.1 MGC13096、PDCD2的基本资料及基因分类（Gene ontology）
• 2.1.1 MGC13096的基本资料
• 2.1.2 Gene ontology对 MGC13096的功能和细胞内定位电子预测
• 2.1.3 PDCD2的基本资料
• 2.2 Gene ontology介绍
• 2.3 如何研究基因功能
• 2.3.1 获得基因
• 2.3.2 组织表达谱分析
• 2.3.3 基因调节
• 2.3.4 蛋白质细胞定位
• 2.3.5 蛋白质相互作用
• 2.3.6 基因功能研究策略
• 参考文献
• 第三部分 实验材料和方法
• 3.1 生物信息学分析
• 3.1.1 在细胞中的定位分析
• 3.1.2 组织表达谱和发育表达谱
• 3.1.3 保守结构域分析
• 3.1.4 转录因子结合位点分析
• 3.1.5 基因表达谱分析
• 3.2 MGC13096、PDCD2转录本1、2编码区（CDS）的克隆
• 3.2.1 RT-PCR MGC13096及真核表达载体的构建
• 3.2.2 RT-PCR PDCD2两个转录本
• 3.2.3 与NCBI Genbank数据库里的序列比对
• 3.3 细胞 DNA提取
• 3.4 MGC13096、PDCD2在凋亡细胞中的表达
• 3.4.1 细胞培养
• 3.4.2 荧光定量 PCR法鉴定 MGC13096、PDCD2的表达
• 3.4.3 流式细胞术分析凋亡组细胞和正常细胞的亚 G0期百分比
• 3.5 细胞转染
• 3.6 HEK293T、pcDNA3.1/293T、MGC13096-pcDNA3.1/293T细胞的生长周期分析，生长曲线，凋亡分析
• 3.6.1 细胞生长周期分析
• 3.6.2 细胞生长曲线
• 3.6.3 凋亡分析
• 3.7 荧光素酶法寻找 MGC13096影响的细胞通路
• 3.7.1 细胞培养
• 3.7.2 制备 DNA-Lipfectamine TM2000复合物
• 3.7.3 转染
• 3.7.4 数据处理
• 3.8 Pull down寻找 MGC13096的相互作用蛋白
• 3.8.1 细胞培养
• 3.8.2 原核表达 MGC13096
• 3.8.3 Pull-down实验
• 3.8.4 蛋白质鉴定
• 3.9 主要分析测试仪器
• 参考文献
• 第四部分 结果和讨论
• 4.1 MGC13096的生物信息学分析
• 4.1.1 Results of Subprograms
• 4.1.2 Results of the k-NN Prediction
• 4.1.3 MGC13096的组织和发育表达谱
• 4.1.4 MGC13096的基因表达谱分析
• 4.2 PDCD2的生物信息学分析
• 4.2.1 Results of Subprograms
• 4.2.2 Results of the k-NN Prediction
• 4.2.3 PDCD2的组织和发育表达谱
• 4.2.4 PDCD2的保守结构域
• 4.2.5 转录因子结合位点
• 4.2.6 PDCD2基因表达谱分析
• C domain的克隆及序列比对'>4.3 MGC13096、PDCD2转录本1、2编码区（CDS）及 PDCD2_Cdomain的克隆及序列比对
• 4.4 MGC13096、PDCD2在凋亡细胞中的表达
• 4.4.1 流式细胞仪分析凋亡细胞和正常细胞的亚 G0期百分比
• 4.4.2 MGC13096、PDCD2在凋亡细胞中的表达
• 4.5 MGC13096的过表达引起细胞生长变缓不是凋亡引起的
• 4.5.1 B12细胞中MGC13096的表达比293T和 H5增加了9倍还多
• 4.5.2 H5，B12细胞生长曲线
• 4.5.3 HEK293T、H5、B12细胞的生长周期分析
• 4.5.4 HEK293T、H5、B12细胞凋亡分析
• 4.6 荧光素酶法寻找 MGC13096影响的细胞通路
• 4.7 Pull down寻找 MGC13096的相互作用蛋白
• 4.7.1 MGC13096-pET32a/BL21（DE3）在几种培养基中的生长曲线
• 4.7.2 原核表达 MGC13096
• C domain'>4.7.3 原核表达 PDCD2_Cdomain
• 4.7.4 Pull-down实验
• 4.7.5 蛋白质鉴定
• 4.8 进一步的研究展望
• 参考文献
• 附录1: 细菌培养基配方
• 附录2: MGC13096的测序报告
• 附录3: 凋亡细胞中MGC13096、PDCD2、18s rRNA的表达
• 附录4: 293T、H5、B12细胞中MGC13096、18s rRNA的表达
• 附录5: MGC13096相互作用蛋白质谱图
• 附录6: 博士生期间发表的论文
• 致谢