猪多杀性巴氏杆菌分离鉴定及其PMT毒素免疫原性研究

论文摘要

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida, Pm）是一种重要的畜禽病原菌,属于巴氏杆菌科,主要使动物发生传染性肺炎或出血性败血病。猪巴氏杆菌病主要有猪传染性萎缩性鼻炎（Swine infectious atrophic rthinitis, AR）和猪肺疫（Pneumonic pasteurellosis）,这两种疾病给养殖业的发展带来巨大的经济损失。由产毒素多杀性巴氏杆菌（toxigenic Pasteurella multocida, T+Pm）和支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica, Bb）引起的猪传染性萎缩性鼻炎是猪的一种常见且危害严重的传染病。接种疫苗是预防和控制AR的主要手段。研究发现,Bb灭活苗中加入从D型T+Pm中提纯的毒素制成联苗,其免疫效果较常规的灭活菌苗及单纯的类毒素疫苗好,但是提取的巴氏杆菌皮肤坏死毒素（Pasteurella multocida toxin, PMT）在灭活和纯化方面没有得到有效的解决,很难实现规模化生产。随着分子生物学的发展,通过生物技术手段对巴氏杆菌毒素进行分段表达,利用表达产物进行疫苗生产是可行的。本研究将产毒素多杀性巴氏杆菌HN-13株的toxA基因N端的1140bp片段克隆到原核表达载体pET-28a系统中,成功构建了pET28a-toxAN重组表达质粒,经诱导表达,获得大小约为45Kda的融合蛋白rtoxAN,经（?）estern blot检测,证实了rtoxAN蛋白具有良好的免疫原性。将此蛋白和灭活的Bb（HH-0809）与白油乳化制成疫苗,进行了疫苗对小鼠、仔猪、妊娠母猪的安全性以及对小鼠和仔猪的免疫保护力研究。同时还开展了从临床患病猪肺、肾、心、肝、脑和脾等器官中分离鉴定多杀性巴氏杆菌的工作。主要研究内容如下：1.猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定2010年从530份临床患病猪肺、肾、心、肝、脑和脾等器官中共分离出148株多杀性巴氏杆菌,其中A型非产毒素多杀性巴氏杆菌68株；D型非产毒素多杀性巴氏杆菌74株；D型产毒多杀性巴氏杆菌3株；未定型的非产毒素多杀性巴氏杆菌3株。2.PMT毒素的免疫原性研究（1）参照toxA基因序列（NO.AF240778）设计引物扩增toxA基因N端,构建重组质粒pET28a-toxAN,并对其进行诱导表达,Western blot显示表达产物rtoxAN蛋白具有良好的免疫原性,同时对表达产物进行纯化。（2）通过在TSB培养基上增殖培养Bb（HH-0809）,收集菌液,进行细菌计数、灭活和浓缩后,和纯化好的rtoxAN蛋白一起与白油乳化制成疫苗,此疫苗中Bb含量为2.0×1010CFU/ml、rtoxAN的含量为100μg/ml。（3）将试制疫苗以每只0.2m1的剂量接种Balb/C小鼠,接种后定期观察,小鼠采食、生长均正常,无异常反应,说明疫苗对小鼠安全。开展了试制疫苗对Balb/C小鼠的免疫保护力试验,将32只4周龄Balb/c雌性小鼠随机分成2组,第1组免疫试制的Bb-toxAN疫苗,第2组注射无菌PBS,首免后2周加强免疫一次。首免后2周、4周分别检测相应的抗体水平。二免后2周,每组一半的小鼠用提取的PMT毒素（6μg）进行攻毒,另一半用5.0×106CFU（10×LD50）HH-0809进行攻毒,观察死亡情况。结果表明,试制疫苗能够激发小鼠产生很高的针对Bb和（?）rtoxAN的IgG抗体；攻毒后,此疫苗针对Bb和PMT毒素的保护率分别为100%和87.5%,而对照组全部死亡。（4）将试制疫苗以每头4m1的剂量分别接种仔猪和妊娠母猪,接种后定期观察,仔猪和妊娠母猪采食、生长均正常,无异常反应,妊娠母猪没有出现早产、流产等现象。说明疫苗对仔猪和妊娠母猪均安全。将15头7日龄的仔猪随机分成3组,第1组免疫制备的Bb-toxAN疫苗,第2组免疫进口的猪萎缩性鼻炎苗,第3组注射无菌PBS,首免后2周加强免疫一次。首免后2周、4周分别检测相应的抗体水平。二免后2周,对所有猪只先用Bb（HH-0809）（3.0×109CFU）滴鼻感染,3天后,所有猪只用PMT毒素（1.2mg/Kg体重）肌肉注射感染,随后观察28天。结果显示两种疫苗均能诱导仔猪产生很高的针对Bb的IgG抗体,但只有Bb-toxAN疫苗组可以诱导仔猪产生很高的针对toxAN的IgG抗体；中和试验表明两种疫苗均能诱导仔猪产生很高的中和抗体；攻毒后发现两种疫苗均可以对仔猪提供80%的保护力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 猪巴氏杆菌病
• 1.1.1 病原学
• 1.1.2 流行病学
• 1.1.3 诊断
• 1.1.4 防治
• 1.2 猪传染性萎缩性鼻炎疫苗的研究进展
• 1.2.1 灭活苗
• 1.2.2 亚单位疫苗
• 1.2.3 基因工程疫苗
• 1.3 PMT毒素的研究进展
• 1.3.1 PMT毒素的一般特性
• 1.3.2 PMT毒素致病机理
• 1.3.3 PMT毒素的免疫原性片段研究
• 1.3.4 PMT毒素检测方法的研究
• 2 研究目的与意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验所用菌株、细胞以及质粒
• 3.1.2 酶和试剂
• 3.1.3 主要培养基及其配制
• 3.1.4 各种缓冲液的配制
• 3.1.5 主要实验仪器
• 3.1.6 引物
• 3.1.7 试验动物
• 3.2 方法
• 3.2.1 猪多杀性巴氏杆菌的分离及鉴定
• 3.2.2 分子生物学基本操作方法
• 3.2.3 重组质粒的构建
• 3.2.4 重组质粒的诱导表达及表达产物的SDS-PAGE电泳
• 3.2.5 表达产物的纯化及Western blot检测
• 3.2.6 针对rtoxAN ELISA抗体检测方法的建立
• 3.2.7 PMT毒素的提取
• 3.2.8 细胞半数感染量试验（TCID50）
• 3.2.9 血清中和试验
• 3.2.10 Bb-toxAN疫苗的制备
• 3.2.11 小鼠实验
• 3.2.12 本动物实验
• 4 结果与分析
• 4.1 猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定
• 4.1.1 猪多杀性巴氏杆菌的分离
• 4.1.2 猪多杀性巴氏杆菌的生化鉴定结果
• 4.1.3 猪多杀性巴氏杆菌的PCR鉴定结果
• 4.2 重组质粒pET28a-toxAN的构建与鉴定
• 4.2.1 免疫原性片段toxAN的克隆与序列分析
• 4.2.2 重组质粒pET28a-toxAN的酶切鉴定
• 4.3 重组质粒pET28a-toxAN的诱导表达及表达产物的纯化
• 4.3.1 重组质粒pET28a-toxAN的诱导表达和纯化
• 4.3.2 纯化产物的Western blot检测
• 4.4 针对rtoxAN ELISA抗体检测方法的建立
• 4.4.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定
• 4.4.2 阴阳界的确定
• 4.5 PMT毒素的半数感染量试验
• 4.6 试验用疫苗的检验结果
• 4.6.1 乳化效果的检验
• 4.6.2 无菌检验结果
• 4.7 小鼠试验
• 4.7.1 小鼠的安全性试验
• 4.7.2 小鼠的免疫保护力试验
• 4.8 本动物试验
• 4.8.1 仔猪的安全性试验
• 4.8.2 妊娠母猪的安全性试验
• 4.8.3 仔猪的免疫保护力试验
• 5 讨论
• 5.1 多杀性巴氏杆菌的分离鉴定
• 5.2 多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的免疫原性研究
• 5.2.1 免疫原性片段的选择
• 5.2.2 Bb毒株的选择
• 5.2.3 攻毒方式的选择
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢