诺如病毒核酸荧光定量检测及其衣壳蛋白基因重组腺病毒免疫效果的研究

论文摘要

杯状病毒（Calicivirus）是一种人畜共患的病原体,是世界范围内人类急性病毒性胃肠炎的主要病原之一,对公共卫生有着重要影响。杯状病毒目前已知能感染人的包括诺如病毒（Norovirus）和札如病毒（Saporovirus）两个属,常在医院、餐馆、学校、托儿所、养老院、军队、家庭及其他人群中引起暴发性非菌性腹泻。根据RNA聚合酶区或外壳蛋白区的核苷酸和氨基酸序列,可将诺如病毒和札如病毒分为不同的基因组,目前已知诺如病毒基因组Ⅰ（GGⅠ）和Ⅱ（GGⅡ）,札如病毒基因组SGⅠ和SGⅡ均可感染人。尽管杯状病毒引起的急性胃肠炎症状（呕吐、腹泻和腹部痉挛等）呈自限性,但若治疗不及时仍会导致死亡,因此检测该病毒的感染情况对于疾病控制和临床诊断均具有重要意义。近年来我国杯状病毒性腹泻发生率呈上升趋势,已在多个地区发生暴发流行。但是由于杯状病毒型别众多,变异频繁,其流行具有一定的地域和时间特征。因此,调查我国不同地区的杯状病毒流行特征、建立可靠的检测技术并开展其疫苗研究,对于全面掌握我国杯状病毒病的流行状况,评估其造成的经济社会负担及制订相应的控制策略具有重要意义。有鉴于此,本实验研究了山东济南地区存在杯状病毒感染的流行状况及其毒株的分子遗传特点,建立了针对流行毒株检测的荧光定量PCR技术,并对诺如病毒GGⅡ4型衣壳蛋白基因重组腺病毒（rvAdGⅡ4）免疫效果进行了研究。取得主要结果如下:一、济南地区婴幼儿腹泻病杯状病毒的流行特征收集了山东济南市儿童医院婴幼儿病毒性腹泻粪便标本,使用文献报道的杯状病毒特异性引物进行了RT-PCR检测。发现在212例病毒性腹泻标本中,杯状病毒RT-PCR阳性62例,检出率为29.25%,2月份为发病高峰。将杯状病毒阳性PCR产物进行克隆和序列分析,结果表明,所有杯状病毒均为诺如病毒基因组GGⅡ型,未见GGⅠ型和札如病毒。对39个毒株的序列分析表明,GGⅡ-4基因型占46.15%,GGⅡ-1基因型占35.90%,GGⅡ-2基因型占17.95%。说明杯状病毒是山东地区婴幼儿腹泻病的主要病原之一,目前以诺如病毒基因组Ⅱ-4型毒株流行为主,与我国其它地区相似。对测序毒株进行核苷酸序列的同源性分析,结果表明其中18株GGⅡ-4型同源性大于95.99%,与Lordsdale株同源性为89.05%～90.15%;14株GGⅡ-1型同源性大于94.16%,与Hawaii株同源性为85.04%～87.59%;7株GGⅡ-2型同源性为大于98.91%,与Melksham株同源性为80.29%～81.02%。39株诺如病毒之间的核苷酸同源性为81.45%～100%。本次测定的基因型内部毒株之间的核苷酸同源性大于94.16%,远高于与参考毒株核苷酸之

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 杯状病毒研究进展
• 1.1 杯状病毒概述
• 1.1.1 杯状病毒的种类
• 1.1.2 人杯状病毒
• 1.2 杯状病毒的检测分析方法
• 1.2.1 电镜法
• 1.2.2 免疫学检测技术
• 1.2.3 分子生物学检测
• 1.3 杯状病毒疫苗的研究进展
• 1.4 荧光定量 PCR 技术及其在兽医学中的应用
• 1.4.1 荧光定量PCR 技术的原理
• 1.4.2 荧光定量PCR 技术的种类
• 1.4.3 荧光定量PCR 技术在兽医学中的应用
• 1.5 论文的研究目的和研究方法
• 第二章 济南地区婴幼儿杯状病毒腹泻病的流行特征
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器和器材
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 临床标本
• 2.2 方法
• 2.2.1 标本处理
• 2.2.2 轮状病毒的ELISA 检测
• 2.2.3 病毒核酸（RNA）的提取
• 2.2.4 逆转录（RT）反应
• 2.2.5 杯状病毒cDNA 的PCR 检测
• 2.2.6 PCR 产物的克隆
• 2.2.7 DNA 重组体的筛选与鉴定
• 2.2.8 DNA 序列分析
• 2.2.9 序列比对与分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 腹泻粪便标本中杯状病毒的检测
• 2.3.2 PCR 产物的克隆和cDNA 序列分析结果
• 2.3.3 杯状病毒基因序列的亲缘性关系分析
• 2.3.4 核苷酸序列的同源性分析
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 GGⅡ型诺如病毒Real-time RT-PCR检测方法的建立
• 3.1 材料
• 3.1.1 临床标本
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器和器材
• 3.2 方法
• 3.2.1 引物和探针的设计
• 3.2.2 重组质粒标准品的制备
• 3.2.3 病毒核酸（RNA）的提取
• 3.2.4 逆转录（RT）反应
• 3.2.5 常规 PCR
• 3.2.6 Real-time PCR
• 3.2.7 体外转录
• 3.2.8 一步Real-time RT-PCR 反应
• 3.2.9 Real-time RT-PCR 各项参数的评价
• 3.2.10 核酸提取方法回收率的分析
• 3.2.11 临床样本的检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 引物与探针设计
• 3.3.2 质粒标准品的制备
• 3.3.3 重组质粒的双酶切鉴定、测序结果
• 3.3.4 重组质粒pcDNAⅡS2-116 的DNA 拷贝数确定
• 3.3.5 诺如病毒GGⅡ型常规RT-PCR 的检出限
• 3.3.6 Real-time RT-PCR
• 3.3.7 Real-time PCR 标准曲线的建立及其灵敏度
• 3.3.8 Real-time PCR 的特异性
• 3.3.9 Real-time PCR 检测的重复性和准确性
• 3.3.10 两步Real-time PCR 扩增效率的验证
• 3.3.11 核酸提取方法的回收率
• 3.3.12 临床腹泻粪便标本的检测
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 诺如病毒衣壳蛋白基因重组腺病毒的免疫活性研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌种及毒种
• 4.1.2 细胞和实验动物
• 4.1.3 试剂
• 4.1.4 仪器设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 重组腺病毒的扩增
• 4.2.2 动物免疫
• 4.2.3 间接 ELISA
• 4.2.4 免疫小鼠脾淋巴细胞的制备
• 4.2.5 小鼠肺灌洗液、肺肝肠匀浆标本、粪便的处理
• 4.2.6 Elispot（固相酶联免疫斑点技术）实验
• 4.3 结果
• 4.3.1 重组腺病毒的扩毒
• 4.3.2 重组腺病毒rvAdGII4免疫小鼠后血清抗体可诱导良好的体液免疫反应
• 4.3.3 重组腺病毒rvAdGII4免疫小鼠后可诱导黏膜免疫
• 4.3.4 重组腺病毒rvAdGII4免疫小鼠后可诱导细胞免疫
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介