论文摘要
在成人中中枢神经系统原发肿瘤中恶性星形胶质细胞瘤（多形性胶质母细胞瘤和间变性星形细胞瘤）是最常见的原发性恶性肿瘤，年发病率约0.005％。因其致死率高、预后差，使得胶质瘤的治疗成为临床神经外科肿瘤治疗的焦点问题。即使通过各种治疗手段，包括手术切除、放疗及化疗，其中位生存期也仅为14-15个月。主要原因是由于肿瘤的浸润性生长使手术无法达到根治性切除以及肿瘤对术后放化疗的不敏感，因此导致临床总体疗效仍不理想。临床上常常出现相同级别胶质瘤接受相同的手术切除和放化疗方案，却表现出完全不同的临床预后，其中除了光镜下不能揭示的肿瘤内在分子机理外，肿瘤细胞对放化疗的敏感性是重要的原因之一。既往研究已发现某些特定基因（包括癌基因及抑癌基因MGMT，Survivin和P53等）的异常表达可影响胶质瘤的放疗及化疗敏感性。因此，寻找新的与化疗敏感性相关的基因并阐明其分子机制已成为神经外科研究的热点之一。我们的前期研究通过对不同级别胶质瘤组织的基因芯片检测以及临床的长期随访，应用生物信息分析方法发现了一组与患者预后及化疗相关的基因和蛋白，其中包括RLIP76，本研究拟对该基因的生物特性及其对化疗敏感性的影响作一探讨。RLIP76是一种能转运不同结构化合物的ATP依赖性转运蛋白（非ABC类）。自从发现RLIP76具有转运功能后，许多研究表明RLIP76在转运化疗药物和抗癫痫药物上有重要作用。其作用底物包括弱阳离子化合物（多西环素，长春花碱，长春新碱，失碳长春花碱，秋水仙碱）和阴离子代谢物（如电子性谷胱甘肽结合物）。由于RLIP76在很多不同组织中广泛表达，特别是在肿瘤组织中表达明显，提示RLIP76在调节内生和异生代谢终端产物上起着重要作用。此外，RLIP76还具有多种生理功能，Ral连接RLIP76后可启动其对CDC42的GTP酶激活蛋白的活性，以此调节细胞的增殖和存活。CDC42是Rho-GTP酶类成员之一，它对细胞形态发生和细胞迁移起重要作用。RLIP76连接AP2和POB1后可抑制网格蛋白介导的胞呑现象，并能抑制表皮生长因子受体、胰岛素受体和肿瘤生长因子的内化作用。因此，RLIP76在细胞正常信号传导通路中起着重要作用。正因为RLIP76是调节多种信号通路的关键因子，且这些通路往往能够影响细胞的生长、迁移、分裂和凋亡，因此对RLIP76的深入研究将有助于理解这些复杂的生理和病理机制。本研究拟首先检测RLIP76在不同病理级别脑胶质瘤组织中以及胶质瘤细胞株中的表达情况，通过构建RLIP76慢病毒干扰及过表达载体感染胶质瘤细胞株，在建立RLIP76不同表达水平的胶质瘤细胞株上探讨RLIP76对胶质瘤细胞生物学行为的影响，随后在裸鼠在体实验中研究RLIP76对移植胶质瘤生长的作用，并进一步深入探究RLIP76影响胶质瘤细胞凋亡的信号通路机制，最后将敲除RLIP76基因的U87和U251胶质瘤细胞在化疗药物替莫唑胺（temozolomide，TMZ）中进行培养，检测肿瘤耐药相关基因MDR、MRP及凋亡相关蛋白的改变，探讨RLIP76在胶质瘤细胞中对化疗药物敏感性的影响。本实验共分五个部分：第一部分，探讨RLIP76在不同级别星型细胞胶质瘤组织中的表达水平及其与患者预后的相关性；第二部分，构建RLIP76慢病毒干扰及过表达载体感染胶质瘤细胞株，建立RLIP76不同表达水平的细胞株；观察RLIP76基因对胶质瘤细胞株增殖、凋亡、侵袭性的影响；第三部分，构建裸鼠成瘤模型，研究抑制RLIP76基因表达联合TMZ治疗对裸鼠移植瘤的治疗效果；第四部分，在U251中通过慢病毒干扰RLIP76的表达，探究RLIP76-Rac1-JNK通路对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响，进一步深入研究不同亚型RLIP76对下游蛋白的影响以及对胶质瘤恶性生物学行为的改变；第五部分，在U87和U251中通过慢病毒靶向抑制RLIP76表达，并与TMZ化疗药物共培养，探究RLIP76基因表达对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响。第一部分RLIP76在脑星形细胞胶质瘤中的表达研究目的：研究RLIP76在不同级别脑胶质瘤组织中的mRNA和蛋白表达水平，并探究其表达水平与患者预后的关系。方法：应用免疫组织化学染色检测RLIP76在99例不同级别星型胶质细胞瘤的蛋白表达水平。在28例不同级别脑星形胶质细胞瘤中应用实时定量PCR（Real-timePCR）和Western blot检测RLIP76基因的mRNA和蛋白表达水平。随后通过收集患者临床资料，利用统计学方法分析其对胶质母细胞瘤患者预后的影响，并初步探索RLIP76与肿瘤增殖蛋白Ki-67和其下游蛋白Rac1表达之间的关系。结果：免疫组化研究发现RLIP76蛋白主要分布在肿瘤细胞核及细胞质，Rac1、JNK蛋白主要分布在细胞质，Ki-67蛋白主要位于细胞核。4种蛋白在低级别胶质瘤中染色阳性率较低，而在高级别肿瘤阳性率较高，Ki-67作为细胞增殖指数，能够标记G和S期的细胞，在多数恶性肿瘤细胞中表达强阳性，Spearman相关分析提示RLIP76与Ki-67成明显正相关，相关系数为0.581。实时定量PCR检测提示RLIP76与其下游基因Rac1的mRNA表达在人脑胶质母细胞瘤标本中明显上调，与低级别相比差异有统计学意义（P＜0.05），而JNK的mRNA表达在两个不同级别胶质瘤中无明显差异。Western-blot与免疫组化结果相似，结果显示RLIP76、Rac1、JNK蛋白水平在胶质母细胞瘤中表达均明显上调，与低级别胶质瘤相比差异有统计学意义（P＜0.05）。单因素方差分析提示RLIP76、Rac1的表达、患者的年龄与预后相关，而肿瘤大小、患者性别等其他临床因素与预后无关。而将单因素分析结果中P <0.2的因素纳入多因素分析发现，仅有RLIP76表达与胶质母细胞瘤患者预后有显著性关系，而Rac1的表达与患者预后无关。结论：RLIP76表达随着胶质瘤病理级别的增高而增高，并与患者的预后明显相关，是预测患者预后的理想指标之一。第二部分RLIP76表达对胶质瘤增殖、侵袭和凋亡的影响目的：通过慢病毒载体靶向抑制或过表达RLIP76基因，探讨在胶质母细胞瘤U87、U251和星形细胞瘤SW1088细胞株中RLIP76基因对肿瘤细胞生长、增殖和凋亡的作用。方法：首先构建RLIP76慢病毒干扰及过表达载体，分别感染U87、U251、SW1088细胞株，在U87和U251中抑制RLIP76表达，在SW1088和U251中过表达RLIP76。随后，经MTT法测定细胞增殖，流式细胞仪AV/PI染色测定细胞凋亡，Transwell实验检测肿瘤细胞的侵袭性。最后，通过RT-PCR和Western blot测定Survivin、Bcl-2、Caspase-3等基因的mRNA和蛋白表达水平变化，初步探其究凋亡机理。结果：RLIP76过表达及干扰载体构建正确，病毒包装成功，滴度分别为4.0×107TU/ml和6.0×107TU/ml。过表达RLIP76（Lenti-RLIP76）和抑制RLIP76表达（Lenti-shRNA）病毒载体感染胶质瘤细胞后可以显著上调或下调其表达。在U251细胞株中，空白对照组、空载体组与RLIP76过表达组相比，在72、96及120小时能够促进细胞生长（72h:1.13±0.012vs1.10±0.04vs1.24±0.012， p<0.05;96h:1.65±0.017vs1.60±0.041vs1.84±0.016， p<0.05;120h:1.83±0.009vs1.81±0.031vs2.10±0.016， p<0.05），空白对照组、空载体组与RLIP76干扰组相比，在72、96及120小时能够抑制细胞生长（72h:1.13±0.012vs1.10±0.04vs0.84±0.01，p<0.05;96h:1.66±0.017vs1.60±0.041vs1.16±0.04， p<0.05;120h:1.83±0.009vs1.81±0.031vs1.34±0.016， p<0.05）。在U87细胞株中抑制RLIP76表达同样能抑制肿瘤细胞生长（72h：1.21±0.02vs1.18±0.03vs0.9±0.05，p<0.05；96h：1.58±0.03vs1.57±0.01vs1.21±0.03，p<0.05；120h：1.92±0.01vs1.89±0.04vs1.48±0.02，p<0.05），而在SW1088中过表达RLIP76蛋白能促进肿瘤细胞生长（72h：1.25±0.032vs1.21±0.12vs1.49±0.032，p<0.05；96h：1.48±0.031vs1.46±0.021vs1.92±0.033，p<0.05；120h：1.63±0.011vs1.67±0.0261vs2.43±0.021，p<0.05）。在U251细胞株中，空白对照组、空载体组与RLIP76过表达组相比，在72小时后能够抑制细胞凋亡（5.63±0.21%vs5.6±0.1%vs3.3±0.12%， p<0.05）；空白对照组、空载体组与RLIP76干扰组相比，在72小时后能够促进细胞凋亡（5.63±0.21%vs5.6±0.1%vs11.8±0.3%， p<0.05）。在U87细胞株中抑制RLIP76表达同样能促进肿瘤细胞凋亡（3.93±0.25%vs3.88±0.1%vs14.38±0.32%，p<0.05），而在SW1088中过表达RLIP76蛋白能抑制细胞凋亡（3.62±0.14%vs3.12±0.21%vs0.87±0.11%，p<0.05）。在U251细胞株中，RLIP76抑制组与空白对照组、空载体组相比，能够显著抑制胶质瘤细胞的侵袭（27±1.25vs25.67±1.53vs11.67±0.578，p<0.05）。在U87细胞株中，抑制RLIP76表达同样能够抑制肿瘤细胞的侵袭（22.63±2.08vs24.67±1.53vs13.33±2.08，p<0.05）。通过电镜观察RLIP76抑制后的U87及U251胶质瘤细胞形态，可见凋亡细胞发生形态改变，内质网扩张，细胞核深染，基核固缩，染色质凝集、边聚、核碎裂，并形成凋亡小体。RT-PCR和Western-blot结果显示，在U251和U87胶质瘤细胞中抑制RLIP76表达后，可下调肿瘤细胞Bcl-2和Survivin的表达、上调Caspase-3的表达，而p53表达无明显改变。在U251和SW1088胶质瘤细胞中过表达RLIP76后，可使肿瘤细胞内Bcl-2、Survivin蛋白表达水平上调，Caspase-3的表达水平明显下降，而p53蛋白表达同样无改变。结论：RLIP76的表达可影响胶质瘤的增殖、凋亡与侵袭。抑制RLIP76表达可抑制肿瘤细胞的生长、促进肿瘤细胞凋亡，降低胶质瘤细胞侵袭能力，并且细胞凋亡与凋亡相关蛋白Bcl-2、Survivin和Caspase-3密切相关，与p53无关。第三部分RLIP76对U251胶质母细胞株裸鼠移植瘤影响的初步研究目的：建立U251细胞裸鼠成瘤模型，观察抑制RLIP76表达后对U251裸鼠成瘤能力的影响并初步探究抑制RLIP76表达联合TMZ治疗对裸鼠移植瘤的影响。方法：随机选取20只裸鼠分4组每组5只，分别于皮下接种2×106个U251细胞、干扰RLIP76后的U251细胞、干扰阴性对照U251细胞，过表达RLIP76后的U251细胞、过表达阴性对照U251细胞，探讨改变RLIP76表达后对裸鼠成瘤能力的影响。记录肿瘤体积变化，待裸鼠自然死亡后获得瘤体，将瘤组织制成石蜡切片，TUNEL染色检验肿瘤细胞凋亡、BrdU检测细胞增殖、免疫组化检测RLIP76蛋白及其下游蛋白Rac1的表达情况。结果：裸鼠生存时间结果显示，U251对照组、干扰阴性对照组及过表达阴性对照组中位生存时间分别为49、51、49天，而RLIP76抑制组裸鼠中位生存时间长达134天，RLIP76过表达组中位生存时间仅为26天，有显著统计学意义（p<0.05）。裸鼠死亡后取其肿瘤组织行肿瘤体积检测，结果显示：U251对照组、干扰阴性对照组及过表达阴性对照组肿瘤平均体积分别为0.032±0.004cm3、0.030±0.002cm3、0.033±0.004cm3，RLIP76抑制组裸鼠肿瘤平均体积为0.011±0.004cm3，RLIP76过表达组平均体积为0.054±0.004cm3，有显著统计学意义（p<0.05）。裸鼠死亡后取其肿瘤行TUNEL检测，结果显示U251对照组、干扰阴性对照组及过表达阴性对照组肿瘤凋亡率分别为37.34±1.01%、41.68±1.13%、39.66±0.7%，RLIP76抑制组裸鼠肿瘤凋亡率为83.76±2%，RLIP76过表达组凋亡率为20.47±1.3%，有显著统计学意义（p<0.05）。裸鼠死亡后取其肿瘤行BrdU检测，结果显示U251对照组、干扰阴性对照组及过表达阴性对照组肿瘤染色率分别为27.56±1.16%、28.78±0.86%、29.33±0.75%，RLIP76抑制组裸鼠肿瘤染色率为8.64±1%，RLIP76过表达组染色率为53.59±1.68%，有显著统计学意义（p<0.05）。免疫组化结果显示RLIP76、Rac1在RLIP76抑制组中表达明显降低，而在RLIP76过表达组中RLIP76、Rac1蛋白表达明显升高，这与临床标本免疫组化检验结果一致。结论：在裸鼠体内实验中发现抑制RLIP76表达可以抑制肿瘤增殖，促进肿瘤凋亡并延长裸鼠生存时间。第四部分RLIP76经Rac1-JNK通路对U251胶质瘤细胞株增殖、凋亡的研究目的：在U251细胞株中，通过慢病毒干扰RLIP76表达，探究其对下游Rac1-JNK通路的影响，并进一步验证RLIP76-Rac1-JNK通路对胶质瘤细胞增殖凋亡的影响。方法：将鉴定有效的靶向干扰RLIP76慢病毒转染于U251细胞株中，Western Blot法检测Rac1和JNK的表达水平，并通过慢病毒转染改变Rac1和JNK的表达，验证三者之间的上下游影响关系。随后在U251中沉默RLIP76表达后，分别导入野生型RLIP76及两种不同亚型的RLIP76（GAP酶失活型和ATP酶失活型），检测不同亚型RLIP76对U251增殖及凋亡活性的影响，并进一步探究不同亚型RLIP76蛋白对下游Rac1泛素化的影响。结果：首先在U251细胞株中抑制RLIP76表达后，可下调Rac1和活性JNK蛋白的表达。其次我们抑制Rac1表达后，发现其并不影响RLIP76的表达，仅能下调JNK的表达。最后抑制JNK表达后，RLIP76及Rac1表达均无改变，这些结果说明在胶质瘤中存在RLIP76-Rac1-JNK通路，并且RLIP76为此通路最上游功能蛋白。接下来我们运用不同亚型RLIP76进一步研究其对Rac1调控的机制。研究发现，GAP失活的RLIP76（R208L/K244R）仍然具有野生型RLIP76的致癌功能，可增加肿瘤细胞克隆形成，降低肿瘤凋亡率，因此单纯抑制RLIP76的GAP功能并不能达到抑制肿瘤生长的效果。ATP失活的RLIP76（K74M/K425M）则丧失野生型RLIP76（WT）的致癌功能，当RLIP76的ATP功能失活时，其致癌作用降低。我们进一步研究发现野生型RLIP76（WT）和GAP失活型RLIP76（R208L/K244R）均可抑制Rac1泛素化，使单体Rac1表达程度增加（30kd），促进肿瘤增殖，而ATP失活型RLIP76蛋白（K74M/K425M）能增加Rac1泛素化作用，从而降低Rac1活性。因此，ATP失活型RLIP76蛋白可通过增加Rac1蛋白泛素化程度，降低下游蛋白活性，由此抑制胶质瘤细胞的增值、促进其凋亡。这说明RLIP76对肿瘤增殖、凋亡的作用主要依靠其ATP活性功能，抑制RLIP76的ATP功能可成为胶质瘤靶向治疗的目标之一。结论：RLIP76通过Rac1-JNK通路调控胶质瘤的增殖与凋亡。GAP酶活性缺失的RLIP76突变体可促进胶质瘤的增殖，抑制其凋亡，仍保有致癌性，而ATP酶活性缺失的RLIP76突变体则对胶质瘤有抑制增殖作用，丧失致癌功能。第五部分RLIP76异常表达对U87、U251胶质母细胞瘤细胞株替莫唑胺敏感性的影响目的：研究在U87、U251胶质瘤细胞株中靶向抑制RLIP76后，胶质瘤细胞对替莫唑胺化疗敏感性的改变。方法：应用RLIP76慢病毒干扰载体感染U87、U251细胞株，建立沉默RLIP76基因的U87、U251细胞系。上述胶质瘤细胞系与不同浓度替莫唑胺共培养三天，MTT法测定第三天细胞抑制率，计算IC50。在替莫唑胺6g/mL浓度下，检测联合抑制RLIP76表达后的细胞凋亡，随后通过RT-PCR和Western blot测定这些胶质瘤细胞株中多药耐药蛋白MRP1、MDP1、凋亡相关基因Bcl-2、Caspase-3的表达水平。结果：通过3天MTT法测肿瘤细胞生长抑制率计算IC50表明，联合运用干扰RLIP76表达与替莫唑胺后可大大降低胶质瘤对化疗药物替莫唑胺的耐药指数。在U87和U251细胞株中单独运用替莫唑胺的耐药指数分别为7.77±1.78g/mL和46.68±1.99g/mL，U87、U251的空载体组与替莫唑胺联合用药的耐药指数分别为7.37±1.07g/mL和48.20±1.77g/mL，联合运用干扰RLIP76表达与替莫唑胺后U87和U251细胞的耐药指数分别为4.08±1.99g/mL和23.68±2.59g/mL。流式细胞仪检测凋亡提示在U251和U87胶质瘤细胞中联合替莫唑胺与抑制RLIP76表达后可促进肿瘤凋亡。联合运用干扰RLIP76表达与替莫唑胺后U87和U251细胞的凋亡率为11.2±0.98%和12.4±1.42%，而U87和U251细胞株中单独运用替莫唑胺的凋亡率为2.98±1.01%和5.12±0.87%，U87、U251空载体组与替莫唑胺联合用药的凋亡率为3.14±0.99%和4.98±0.81%。RT-PCR和Western-blot结果显示，在U251和U87胶质瘤细胞中联合替莫唑胺与抑制RLIP76表达后，较单独运用替莫唑胺相比，可进一步下调肿瘤细胞Bcl-2表达，上调Caspase-3的表达，而对U87和U251中的多药耐药蛋白MDP1和MRP1没有影响。因此抑制RLIP76表达后能促进胶质瘤对替莫唑胺敏感性的作用机制是主要增加了胶质瘤细胞的凋亡率，这与显著降低Bcl-2和增加Caspase-3表达密切相关。通过RT-PCR和Western-blot检测发现，抑制RLIP76表达并不影响多药耐药蛋白（MDP1和MRP1）的表达，因此，RLIP76表达改变并不影响其他转运蛋白的表达，RLIP76抑制剂可作为独立的化疗增敏剂增加临床的化疗效果。结论：抑制RLIP76表达可以增加胶质瘤对替莫唑胺的化疗敏感性，这主要是加强了胶质瘤的凋亡程度，并不影响其他多药耐药蛋白的表达。