甜菜M14品系特异表达基因M14-341在模式植物中的表达研究

论文摘要

甜菜M14品系为郭德栋等人通过栽培甜菜（Beta vulgaris L.）和野生种白花甜菜（Beta corolliflora Zoss.）种间杂交及回交,获得的带有白花甜菜染色体的单体附加系（VV+1C,2n=19）,附加染色体的传递率高达96.5%。甜菜M14品系是以二倍体孢子无融合生殖为主要繁殖方式,有性生殖为次要繁殖方式的兼性无融合生殖体。这种具有无融合生殖特性的甜菜M14品系的获得,为我们提供了一种良好的寻找无融合生殖相关基因的材料。本实验室前期采用抑制消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）和mRNA差异显示技术（differential-display reverse transcription-PCR,DDRT-PCR）获得了298个甜菜M14品系特异表达的ESTs（expression sequence tags,ESTs）,并挑选其中有研究价值的EST作为获得全长的侯选EST,通过快速扩增cDNA末端法（rapid amplification of cDNA ends,RACE）获得了甜菜M14品系特异表达的M14-341基因的cDNA全长。经生物信息学分析,M14-341基因编码的蛋白包括MADS-box结构域和K-结构域,并与菠菜（Spinacia oleracea）开花转录因子有88%的相似性,可以判定M14-341基因属于MADS-box基因。为进一步研究M14-341基因的功能以及M14-341基因与无融合生殖现象的关系,本实验首先利用DNAMAN软件将M14-341蛋白与拟南芥（Arabidopsis thaliana）中部分MIKC族蛋白及其它物种的MADS-box蛋白进行了同源比对,结果表明,M14-341蛋白与拟南芥中AG蛋白同源性达74%,可以将其归为AG基因（MADS-box基因家族“ABCDE”模型中的C类基因）的同源基因,其功能为控制花器官的发育。随后,构建了带有M14-341基因cDNA全长的植物表达载体pBI-M14-341,分别利用农杆菌介导的叶盘法和花头浸泡法将M14-341基因转入模式植物烟草和拟南芥中,以分析转基因植株的表型变化进而推测M14-341基因的功能。经过PCR检测、RT-PCR、Southern印迹、Northern印迹及GUS染色等分子生物学检测后,共获得24株转基因烟草和12株转基因拟南芥,进一步研究表明,M14-341基因在转基因植株花器官中表达量较高,在叶和茎中表达量微弱。对转基因植株的表型观测发现:M14-341基因在转基因植株中的组成型表达主要影响了烟草的花期及花器官的发育,转基因烟草出现花期延迟,花瓣颜色变浅,数量变少,花萼与花瓣转变为雄蕊、雌蕊类似结构,雄蕊、雌蕊变长,果实与种子的少育或不育等现象;转M14-341基因的拟南芥出现结实率降低,死亡率增高等变化。对转M14-341基因烟草花器官与作为对照的未转基因的野生型烟草花器官的总蛋白进行双向电泳,结果显示:转M14-341基因烟草植株与野生型烟草对照植株两者的蛋白质点分布情况非常相似,蛋白质点主要集中在分子量20100 kD之间,而且大部分蛋白质的表达丰度都很低;共发现表达差异蛋白点8个,其中转M14-341基因烟草植株中表达消失的蛋白质点1个;新表达的蛋白质点1个;表达程度减弱的蛋白质点5个;表达程度增强的蛋白质点1个。实验结果表明:甜菜M14品系特异表达基因M14-341与AG类基因有相似的功能,在植物花各轮器官的分化发育及调控花期中起重要的作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 无融合生殖现象及其研究进展
• 1.2 本实验室的工作
• 1.3 植物MADS-box基因的研究进展
• 1.3.1 MADS-box基因概述
• 1.3.2 植物MADS-box蛋白的结构
• 1.3.3 MADS-box基因与花发育的关系
• 1.3.4 MADS-box基因调控花期及在花以外器官中的作用
• 1.4 农杆菌介导的植物遗传转化
• 1.5 蛋白质双向电泳技术
• 1.6 本实验的内容及目的
• 1.7 本实验的技术路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株及质粒载体
• 2.1.3 主要实验仪器及试剂
• 2.1.4 M14-341基因cDNA全长序列及引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 M14-341蛋白的同源性分析
• 2.2.2 目的基因M14-341 cDNA全长的扩增
• 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测及胶的回收
• 2.2.4 目的基因M14-341 在野生型烟草及拟南芥中的扩增
• 2.2.5 植物表达载体pBI-M14-341的构建
• 2.2.6 转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定
• 2.2.7 电击法转化农杆菌EHA105菌株及阳性克隆子的筛选与鉴定
• 2.2.8 叶盘法转化烟草
• 2.2.9 花头浸泡法转化拟南芥
• 2.2.10 转基因再生植株的分子生物学检测
• 2.2.11 转基因再生植株的组织化学检测
• 2.2.12 转基因再生植株的形态学观察及异常形态分析
• 2.2.13 烟草转基因植株的蛋白质双向电泳
• 第3章 结果与分析
• 3.1 M14-341蛋白的同源性分析
• 3.2 目的基因M14-341 cDNA全长的扩增
• 3.3 目的基因M14-341 在野生型烟草及拟南芥中的扩增
• 3.4 植物表达载体的构建
• 3.4.1 质粒载体pBI121的制备
• 3.4.2 质粒载体pBI121的酶切反应
• 3.4.3 基因M14-341 cDNA全长的双酶切反应
• 3.5 大肠杆菌DH5α阳性克隆子的筛选与鉴定
• 3.6 植物表达载体pBI-M14-341导入根癌农杆菌
• 3.6.1 根癌农杆菌EHA105阳性克隆子的筛选
• 3.6.2 根癌农杆菌EHA105阳性克隆子的鉴定
• 3.7 根癌农杆菌介导的模式植物的遗传转化
• 3.7.1 烟草遗传转化体系的优化
• 3.7.2 叶盘法转化烟草及花头浸泡法转化拟南芥
• 3.8 转基因再生植株的分子生物学检测
• 3.8.1 M14-341在转基因再生烟草基因组DNA中的PCR检测
• 3.8.2 Southern印迹检测
• 3.8.3 M14-341在转基因再生烟草花、茎、叶中的RT-PCR检测
• 3.8.4 Northern印迹检测
• 3.9 烟草转基因再生植株的组织化学检测
• 0代转基因植株的分子检测'>3.10 拟南芥T₀代转基因植株的分子检测
• 0代拟南芥转基因植株基因组DNA的PCR检测'>3.10.1 T₀代拟南芥转基因植株基因组DNA的PCR检测
• 0代拟南芥转基因植株的RT-PCR检测'>3.10.2 T₀代拟南芥转基因植株的RT-PCR检测
• 3.11 转基因烟草植株与对照植株差异表达蛋白的分析
• 3.12 转基因再生植株的形态学观察及异常形态分析
• 0代'>3.12.1 烟草转基因植株T₀代
• 0代'>3.12.2 拟南芥转基因植株T₀代
• 第4章 讨论
• 4.1 M14-341基因在转基因植株中的表达情况
• 4.2 M14-341基因对花发育的影响
• 4.3 M14-341基因对转基因植株花色的影响
• 4.4 M14-341基因对转基因植株果实与种子的影响
• 4.5 M14-341基因对转基因植株花期的影响
• 4.6 少数转化植株中 A 类基因活性明显增高的原因分析
• 4.7 转基因烟草植株与野生型植株差异表达蛋白分析
• 4.8 本实验下一步的工作
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文