“一剂双靶”新型抑制剂先导结构的生物合理设计与筛选

论文摘要

果糖-1,6-二磷酸酶（FBPase）和果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（Fba）是参与Calvin循环,糖酵解和糖质新生代谢的重要调控酶,对生命体的能量代谢极其重要,具有重要的医学和农学意义。目前,人体内的Ⅰ型FBPae是治疗Ⅱ型糖尿病的靶标,针对其变构位点的抑制剂在临床试验中。细菌中的Ⅱ型Fba被认为是一种理想的杀菌剂靶标,并且在医用疫苗,免疫检测上都有重大的医用价值。研究表明,蓝藻细胞内的Ⅱ型FBPase兼具有SBPase的功能,是一种双功能酶,即蓝藻FBP/SBPase.现代分子生物学技术证明了蓝藻FBP/SBPase和II型的Fba都是蓝藻生长过程中必不可少的调控酶,是具有开发前景的农药杀藻剂的重要作用靶标。稻瘟病是水稻三大病害之首,因而稻瘟菌杀菌剂的研发和应用受到广泛重视。甾醇14α脱甲基化酶（CYP51）是以三唑类化合物为典型代表的许多重要内吸性甾醇14α脱甲基化酶抑制剂（DMIs）的重要靶酶。三羟基萘酚还原酶（3HNR）和小柱孢酮脱水酶（SD）是黑色素生物合成抑制剂（MBIs）的两个重要靶酶。三环唑等MBIs类抑制剂已经有超过三十多年的使用历史。由于对病原菌没有直接的杀菌或抑菌作用,MBIs具有较低的抗药性风险,是未来稻瘟菌杀菌剂研发的重要方向之一。本文综合运用分子模拟、克隆表达、定点突变、酶学分析、晶体解析等多学科方法和多靶标抑制剂设计思想,理论与实验相结合,对蓝藻和稻瘟菌代谢过程中的这些重要调控酶的活性空腔结构信息及其与底物或抑制剂的相互作用机制进行了深入的研究。在此基础上,分别针对蓝藻FBP/SBPase和I型的Fba,稻瘟菌CYP51和3HNR,稻瘟菌CYP51和SD进行了“一剂双靶”抑制剂的设计和筛选研究。主要进行了如下五个方面的工作：一、构建了蓝藻FBP/SBPase和II型的Fba、稻瘟菌3HNR和SD的表达载体,并建立了这些重组酶异原活性表达及纯化的方法。二、运用同源模建方法构建了蓝藻FBP/SBPase和II型的Fba,及稻瘟菌CYP51的合理理论三维结构。预测了蓝藻FBP/SBPase和II型的Fba活性空腔的重要氨基酸残基,并进行了定点突变研究。在理论上,运用分子动力学模拟和FMO结合能计算揭示了蓝藻FBP/SBPase底物活性空腔中三个金属离子和一些重要氨基酸参与酶催化的机制。进一步解析获得了两个蓝藻FBP/SBPase复合物晶体结构,证明了理论计算结果的正确性。对蓝藻FBP/SBPase复合物晶体结构分析,表明该酶是一个同源四聚体,具有三类特殊位点或域,即底物结合位点,AMP变构位点,和二硫键域。这些位点间通过复杂的协同调控机制来调控蓝藻FBP/SBPase的活性。三、在理解靶酶活性空腔结构的基础上,基于蓝藻FBP/SBPase和II型的Fba活性空腔亲水性并富含氢键供体和受体的特点,设计筛选了一批苗头化合物。并从靶酶抑制实验和藻体抑制实验证明了所筛选的化合物中,CFL20和CFL23能较好的抑制蓝藻FBP/SBPase和II型Fba的活性,并且具有很好抑藻活性。根据CFL23的结合方式,指导结构优化并定向合成了a和b两个系列化合物。这些化合物对蓝藻FBP/SBPase和Ⅱ型Fba普遍都有较好的抑制活性和抑藻活性。相比CFL23,有些化合物的抑制活性能提高一个数量级。进一步分析了这些化合物的构效关系。这些化合物的成功设计筛选研究为农药杀藻剂的创制工作提供了宝贵的理论资料和工作经验,并为Ⅱ型Fba抑制剂的设计提供了借鉴。四、针对稻瘟菌CYP51和3HNR受体活性空腔特点,设定了受体药效团模型,通过预定的筛选策略筛选了44个候选化合物供活性测试。活性实验表明这批化合物中,ZY9对稻瘟菌CYP51的抑制结合常数Kd值为29.78nM,对3HNR的抑制常数IC50为19.7μM,并且能在菌体水平上抑制稻瘟菌生长和黑色素的分泌。ZY9的成功设计筛选证明了针对稻瘟菌CYP51与3HNR的双靶酶抑制剂设计的可行性和我们虚拟筛选策略的合理性。五、针对稻瘟菌CYP51和SD受体活性空腔和已知高活性抑制剂结构特点,设定了受体和配体药效团模型,通过预定的筛选策略筛选了50个候选化合物供活性测试。分析了这批化合物在稻瘟菌CYP51和SD受体活性空腔中的结合模式,有望实现同时作用于稻瘟菌CYP51和SD,并且能在菌体水平上抑制稻瘟菌生长和黑色素的分泌。综上所述,本文针对蓝藻和稻瘟菌代谢过程中的几个重要调控酶运用多学科方法和多靶标抑制剂设计思想,理论与实验相结合,在认识靶酶活性空腔结构信息及其与底物或抑制剂的相互作用机制的基础上,成功的设计了蓝藻FBP/SBPase和Ⅱ型Fba的双靶抑制剂,及稻瘟菌CYP51和3HNR的双靶抑制剂,并对蓝藻FBP/SBPase的特殊晶体结构进行了讨论。本文的研究为新型农药杀藻剂和杀菌剂的创作工作提供了重要的理论指导和新思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 本论文的主要创新点
• 第一章 文献综述——研究背景介绍
• 1.1 蓝藻水华及其防治
• 1.2 Calvin循环,糖酵解和糖质新生代谢
• 1.2.1 Calvin循环
• 1.2.2 糖酵解和糖异生代谢
• 1.3 果糖-1,6-二磷酸酶和景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶的相关研究
• 1.3.1 果糖-1,6-二磷酸酶的分类
• 1.3.2 人和动物的果糖-1,6-二磷酸酶
• 1.3.3 植物的果糖-1,6-二磷酸酶和景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶
• 1.3.4 大肠杆菌、蓝藻等低等生物的果糖-1,6-二磷酸酶
• 1.4 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶的相关研究
• 1.4.1 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶的分类
• 1.4.2 Ⅰ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶
• 1.4.3 Ⅱ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶
• 1.5 水稻稻瘟菌病及其防治
• 1.5.1 水稻稻瘟病和稻瘟菌
• 1.5.2 水稻稻瘟病的防治
• 1.6 甾醇14α去甲基化酶的相关研究
• 1.6.1 甾醇14α去甲基化酶的结构
• 1.6.2 甾醇14α去甲基化酶的抑制剂
• 1.7 黑色素生物合成抑制剂的研究
• 1.7.1 三羟基萘酚还原酶及其抑制剂
• 1.7.2 小柱胞酮脱水酶及其抑制剂
• 1.8 多靶标抑制剂设计的设计策略
• 1.9 本论文研究的设计思想及目标
• 1.10 本论文的主要研究工作
• 第二章 “一剂双靶”新型杀藻剂先导结构的生物合理设计与筛选
• 2.1 前沿
• 2.2 蓝藻FBP/SBPase和Ⅱ型Fba的克隆与表达
• 2.2.1 实验目的
• 2.2.2 蓝藻FBP/SBPase表达载体的构建
• 2.2.3 蓝藻FBP/SBPase表达纯化体系的建立
• 2.2.4 蓝藻Ⅱ型Fba表达载体的构建
• 2.2.5 蓝藻Ⅱ型Fba表达纯化体系的建立
• 2.2.6 实验结果与讨论
• 2.2.7 小结
• 2.3 蓝藻果糖-1,6-二磷酸酶（FBPase）的结构和功能研究
• 2.3.1 前沿
• 2.3.2 蓝藻FBP/SBPase与底物FBP和SBP的分子动力学模拟
• 2.3.3 蓝藻FBP/SBPase活性空腔氨基酸残基与底物FBP配对能的计算
• 2.3.4 蓝藻FBP/SBPase的品体培养,解析及定点突变研究
• 2.3.5 结果与讨论
• 2.4 蓝藻Ⅱ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶的结构预测及突变研究
• 2.4.1 前沿
• 2.4.2 蓝藻Ⅱ型醛缩酶的结构预测
• 2.4.3 蓝藻Ⅱ型醛缩酶的定点突变
• 2.4.4 蓝藻Ⅱ型醛缩酶突变体的活性测试
• 2.4.5 结果与讨论
• 2.5 针对蓝藻FBP/SBPase和Ⅱ型Fba的双靶酶抑制剂生物合理设计
• 2.5.1 前言
• 2.5.2 基于蓝藻FBP/SBPase和Ⅱ型Fba结构的双靶酶抑制剂设计
• 2.5.3 基于蓝藻FBP/SBPase和Ⅱ型Fba结构的苯甲酰肼类衍生物的合理设计与合成
• 2.6 双靶抑制剂苗头化合物的活性测试研究
• 2.6.1 前言
• 2.6.2 重组酶抑制活性的测定
• 2.6.3 集胞藻PCC 6803藻体抑制活性的测定
• 2.6.4 化合物的抑制活性分析
• 2.7 本章小结
• 第三章 “一剂双靶”稻瘟菌新型杀菌剂先导结构的生物合理设计与筛选
• 3.1 前言
• 3.2 稻瘟菌3HNR和SD的克隆与表达
• 3.2.1 实验目的
• 3.2.2 稻瘟菌3HNR和SD表达载体的构建
• 3.2.3 稻瘟菌3HNR和SD异原表达纯化体系的建立
• 3.2.4 结果与讨论
• 3.2.5 小结
• 3.3 稻瘟菌CYP51的分子模拟研究
• 3.3.1 前沿
• 3.3.2 稻瘟菌CYP51的同源模建
• 3.3.3 稻瘟菌CYP51的分子动力学模拟
• 3.3.4 结果与讨论
• 3.4 针对稻瘟菌CYP51与3HNR的双靶酶抑制剂生物合理设计
• 3.4.1 前言
• 3.4.2 基于稻瘟菌CYP51和3HNR受体活性空腔的双靶酶抑制剂生物合理设计
• 3.5 针对稻瘟菌CYP51与SD的双靶酶抑制剂生物合理设计
• 3.5.1 前言
• 3.5.2 基于稻瘟菌CYP51与SD受体活性空腔的双靶酶抑制剂生物合理设计
• 3.6 双靶苗头化合物的活性测试研究
• 3.6.1 前言
• 3.6.2 重组瘟菌CYP51和3HNR酶抑制活性的测定
• 3.6.3 稻瘟菌菌体及稻瘟菌黑色素分泌抑制活性的测定
• 3.6.4 化合物的抑制活性分析
• 3.7 本章小结
• 第四章 全文总结与展望
• 4.1 全文总结
• 4.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 个人简历
• 在读期间发表的学术论文和研究成果
• 致谢