转非专一性脂转移蛋白和核糖体失活蛋白基因烟草的抗病性研究

论文摘要

植物病害是农业生产的主要限制因子之一。目前人类克服植物病害的重要途径之一是利用抗性资源、通过常规育种方法培育抗病品种。然而由于病原菌变异迅速、植物抗性资源有限以及常规育种方法耗时费力,所培育的抗病品种远不能满足生产上的需要。随着分子生物学的发展,利用基因工程技术将抗病基因导入受体成为获得抗性植物的重要捷径之一。 本实验以美国烟草（Nicotiana tabacum cv. Xanthi.）的叶盘为受体,通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法分别将来自益母草的核糖体失活蛋白基因RIP、脂转移蛋白基因Lh-L和相应的改造基因Lh-S导入烟草,并进行抗病分析。通过比较转基因植株的抗病性,筛选出了抗病效果较好的功能基因,从而为其它植物进行抗病基因工程奠定了基础。取得的主要结果如下: 1.目的基因的转化与植株再生 采用叶盘法,通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导分别将核糖体失活蛋白基因RIP、脂转移蛋白基因Lh-L和相应的改造基因Lh-S导入了烟草,各获得50多株转基因烟草。 2.转基因烟草的分子生物学鉴定 首先对筛选到的抗性植株进行GUS组织化学检测,初步筛选并确定转化植株。然后对GUS染色呈阳性植株再进行PCR检测。结果表明GUS阳性株系均出现一条与阳性对照相同的特异带,而非转化植株则未得到该特异带,从而进一步证明了3个外源基因均已整合进烟草基因组中。RT-PCR分析表明外源基因能在宿主烟草中稳定表达。 3.外源基因的遗传稳定性检测 每个基因随机选取3个株系,每个株系选取300～700个T0代种子,发芽后进行GUS组织化学染色。统计阳性和非阳性的比例并进行卡方检验,结果表明转基因株系T0代萌芽种子的GUS染色分离比例与孟德尔单基因独立遗传分配规律（3:1）无显著性差异。结合PCR结果认为外源基因以单位点单拷贝的形式整合进了烟草基因组中。 4.抗病检测方法的确定 通过不同方法配制赤星病菌的孢子悬浮液,最终确定单层滤纸过滤孢子悬浮液的方法较

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 一 文献综述
• 1.1 植物基因工程常用的外源基因转化方法
• 1.2 植物抗病基因工程的研究
• 1.3 非专一性脂转移蛋白基因在植物基因工程中的研究与应用
• 1.4 核糖体失活蛋白基因在植物基因工程中的研究与应用
• 1.5 烟草抗病害基因工程研究
• 二 引言
• 三 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 四结果与分析
• 4.1 转LH-L、LH-S和RIP基因植株的获得
• 4.2 转化株的生物学鉴定
• 4.3 转基因烟草的RT-PCR分析
• 1代遗传稳定性检测'>4.4 转基因植株T₁代遗传稳定性检测
• 4.5 赤星病菌接种浓度的确定
• 4.6 青枯病菌接种浓度的确定
• 0代植株对烟草赤星病的离体抗性分析'>4.7 转基因T₀代植株对烟草赤星病的离体抗性分析
• 4.8 转基因烟草对青枯病菌的活体抗性检验
• 五 讨论
• 5.1 转基因植物的遗传分离
• 5.2 烟草赤星病与青枯病不同接菌方法的探讨
• 5.3 基因表达量与抗病性之间的关系
• 5.4 转基因烟草的抗病遗传稳定性
• 六 小结
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢