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静水压下芹菜素对人椎间盘髓核细胞凋亡及基质代谢的影响

2020-12-11阅读(784)

静水压下芹菜素对人椎间盘髓核细胞凋亡及基质代谢的影响

论文摘要

研究背景由于腰椎间盘退变导致的腰椎间盘突出、腰椎管狭窄等疾病是骨科门诊的常见病。随着我国老龄化社会的到来,腰椎退行性疾患对人民健康已构成威胁并严重影响患者的生活质量。随着机械化及电脑办公的普及,以坐姿进行工作的人越来越多,由此导致的腰椎间盘突出症患者呈上升趋势,且发病趋于年轻化,因此腰椎间盘退行性病变已成为当今研究的热点问题。椎间盘退变已成为困扰骨科医生的问题之一,椎间盘一旦退变难以逆转。目前的治疗方法有保守治疗和手术治疗,手术在一定程度上缓解了临床症状,但仍未阻断椎间盘的退变进程。而且脊柱内固定手术会导致脊柱生物力学结构的改变,加速邻近节段椎间盘的退变,同时给患者在心理上和经济上带来严重的负担。因此,如何阻止或延缓腰椎间盘退变成为研究的焦点。研究目的探讨人髓核细胞在体外构建的静水压环境下,芹菜素（Apigenin, API）对其功能状态、凋亡率及基质金属蛋白酶MMP-3及其抑制因子TIMP-1的影响。研究芹菜素作为一种中药类一氧化氮合酶（NOS）抑制剂在延缓腰椎间盘退变方面的可能性并揭示其部分作用机理,为中医药防治椎间盘退行性疾病寻求新的思路。研究方法1.选择由美国ScienCell Research Laboratories提供的人椎间盘髓核细胞Human Nucleus Pulposus Cells （HNPC）进行实验室培养扩增、传代,并对各代次（P1-P7）髓核细胞进行形态学观察,生长增殖活性检测以及主要细胞外基质表达（蛋白多糖、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原）进行分析,选择合适代次的髓核细胞进行药物及静水压干预研究。2.研究芹菜素对体外单层培养的人髓核细胞NO产生量的影响及药物的剂量依赖性,使用经典一氧化氮供体药物（Sodium Nitroprusside,Dihydrate, SNAP）及一氧化氮合酶抑制剂（NG-Monomethyl-L-arginine, Monoacetate Salt, L-NMMA）与芹菜素进行对照分析研究,探讨芹菜素作为一种类一氧化氮合酶（NOS）抑制剂的可行性。3.对原英国牛津大学生理学研究所和日本宇宙开发医学研究中心共同研制的静水压装置进行合理改进,构建一种加压方便,操作安全的体外单层细胞静水压加载系统。分析不同静水压环境下髓核细胞在形态、存活率以及功能状态等方面的差异,论证该细胞静水压加载系统的可行性,确定下一步实验所采用的静水压力值及加载时间。4.使用已构建的单层细胞静水压加载系统及具有NOS抑制作用药物芹菜素对人髓核细胞进行综合干预。观察不同静水压环境下芹菜素对人髓核细胞的影响,对髓核细胞凋亡率、MMP-3及TIMP-1产生量以及Ⅱ型胶原表达情况进行检测,对实验结果进行统计学处理,分析芹菜素在不同静水压环境下对髓核细胞凋亡率、MMP-3与TIMP.1的平衡表达及细胞外基质的影响。探讨中药芹菜素用于延缓腰椎间盘退变的可行性并揭示部分作用机理。研究结果1.人正常椎间盘髓核细胞可以在体外单层培养条件下获得良好的生长状态。前4代细胞形态良好,增殖能力强,并且表型表达稳定,属于正常状态的人髓核细胞。随着传代次数的增多会出现“去分化”现象：传5代时不仅蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达减少,同时细胞增殖能力降低,而且出现Ⅰ型胶原的表达,说明细胞出现老化现象,不宜作为椎间盘髓核细胞研究的对象。2.芹菜素和L-NMMA在抑制髓核细胞NO产生方面具有类似的作用,当芹菜素浓度为12.5μmol/L时能明显降低髓核细胞NO产生量,L-NMMA药物浓度为200μmol/L时也能明显降低髓核细胞NO产生量,两者在抑制作用方面没有明显差异,但芹菜素药用浓度明显低于L-NMMA。SNAP药物浓度在500μmol/L时能明显增加髓核细胞NO产生量。3.构建的细胞静水压加载系统能提供较宽范围的应力水平,符合多种实验研究的需要,且具有良好的生物相容性。单层培养的髓核细胞在0.3Mpa静水压下,持续受压120min时,髓核细胞的形态较好,存活率相对较高,蛋白多糖等胞外基质表达旺盛,而在3Mpa静水压下持续受压120min时,髓核细胞的存活率下降,胞外基质表达明显较少,处于功能抑制状态。4.芹菜素作为一种NOS抑制剂能够对髓核细胞的功能状态、凋亡率以及基质金属蛋白酶的代谢产生影响,而且这种影响在不同的静水压环境下有所不同：在0.3Mpa静水压下,芹菜素通过调节基质金属蛋白酶MMP-3与TIMP-1之间的平衡能减少髓核细胞外基质PG及Ⅱ型胶原的分解,改善由于高浓度NO引起的髓核细胞功能抑制状态；而在3Mpa静水压下,芹菜素在降低髓核细胞的凋亡率,减少胞外基质的过度分解方面有一定作用。结论芹菜素是一种安全有效的中药类NOS合酶抑制剂,能够减少髓核细胞的NO产生量。芹菜素通过调节基质金属蛋白酶MMP-3与TIMP-1之间的平衡减少髓核细胞外基质PG及Ⅱ型胶原的分解,改善由于NO刺激引起的髓核细胞功能抑制状态,并能降低高静水压下髓核细胞的凋亡率,从而对椎间盘髓核细胞及胞外基质起到一定的保护作用。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 英文缩略语词
  • 文献综述
  • 综述1 腰椎间盘退变与生物力学因素关系的研究进展
  • 1. 椎间盘的生物力学特性
  • 2. 压应力对椎间盘细胞及细胞外基质的影响
  • 3. 牵拉应力对椎间盘细胞及细胞外基质的影响
  • 4. 椎间盘细胞应答生物力学干预的机制研究进展
  • 5. 总结和展望
  • 参考文献
  • 综述2 腰椎间盘退变与基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制因子（TIMPs）的关系
  • 1. MMPs及TIMPs的理化特性及功能
  • 2. MMPs及TIMPs与椎间盘退变的关系
  • 3. 影响MMPs和TIMPs失衡的因子及调节机制
  • 4. 总结和展望
  • 参考文献
  • 综述3 椎间盘退变与一氧化氮（NO）关系的研究进展
  • 1. 一氧化氮（NO）在退变椎间盘中的组织学定位研究
  • 2. 一氧化氮（NO）对椎间盘基质及细胞的影响
  • 3. 一氧化氮（NO）引起椎间盘退变的相关机制研究
  • 4. 总结和展望
  • 参考文献
  • 综述4 腰椎间盘退变与细胞生长因子关系的研究进展
  • 1. 转化生长因子-β（TGF-β）
  • 2. 胰岛素样生长因子（IGFs）和血小板衍生生长因子（PDGF）
  • 3. 成纤维细胞生长因子（FGF）和表皮生长因子（EGF）
  • 4. 总结和展望
  • 参考文献
  • 综述5 中药提取物——芹菜素（apigenin,API）药理研究进展
  • 1. 对组织、器官及系统的保护作用
  • 2. 保健作用
  • 3. 抗肿瘤
  • 4. 降压和降脂
  • 5. 降糖
  • 6. 其他作用
  • 7. 总结和展望
  • 参考文献
  • 前言
  • 1.腰椎间盘退行性病变的现状
  • 2.腰椎间盘退变的病因、病理学基础
  • 3.研究意义
  • 第一部分 人椎间盘髓核细胞的培养扩增、传代及生物学特性的研究
  • 引言
  • TM实验室提供的人髓核细胞证书'>由美国ScienCellTM实验室提供的人髓核细胞证书
  • 材料和方法
  • 1. 实验材料
  • 1.1 实验试剂
  • 1.2 主要实验仪器及用品
  • 2. 实验方法
  • 2.1 髓核细胞株（HNPC）的培养、增殖及传代过程
  • 2.2 髓核细胞（HNPC）培养的连续形态学观察
  • 2.3 髓核细胞计数
  • 2.4 髓核细胞增殖活性检测（MTT）
  • 2.5 髓核细胞主要基质成分表达量检测
  • 3. 统计学处理
  • 结果
  • 1. 髓核细胞形态学观察情况
  • 1.1 倒置相差显微镜下观察情况
  • 1.2 透射电子显微镜下观察情况
  • 2. 髓核细胞计数与细胞生长曲线
  • 3. MTT摄取实验检测髓核细胞增殖活性
  • 4. 髓核细胞主要基质成分表达量检测
  • 讨论
  • 小结
  • 参考文献
  • 第二部分 芹菜素、SNAP、L-NMMA对人髓核细胞产生NO的剂量依赖性研究
  • 引言
  • 材料和方法
  • 1. 实验材料
  • 1.1 实验试剂
  • 1.2 主要实验仪器及用品
  • 2. 实验方法
  • 2.1 实验对象:使用传4代髓核细胞进行实验
  • 2.2 干预药物（芹菜素、SNAP、L-NMMA）溶液的制备
  • 2.3 药物干预剂量范围设定
  • 2.4 实验分组
  • 2.5 药物干预NO释放量测定
  • 3. 统计学处理
  • 实验结果
  • 1. 各组药物对髓核细胞一氧化氮释放量的影响
  • 2. 各组药物作用后髓核细胞形态学观察
  • 讨论
  • 小结
  • 参考文献
  • 第三部分 构建髓核细胞体外静水压加载系统及其可行性探讨
  • 引言
  • 材料和方法
  • 1. 实验材料
  • 1.1 实验试剂
  • 1.2 主要实验仪器及用品
  • 2. 实验方法
  • 2.1 静水压加载系统的设计原理及主要构成
  • 2.1.1 静水压装置的设计原理
  • 2.1.2 静水压加载系统的设计标准及主要构成
  • 2.2 实验设计
  • 2.2.1 髓核细胞的传代、铺片
  • 2.2.2 髓核细胞静水压加载
  • 2.2.3 髓核细胞静水压加载实验分组
  • 2.2.4 髓核细胞形态学观察
  • 2.2.5 髓核细胞存活率检测
  • 2.2.6 髓核细胞蛋白多糖表达情况检测
  • 3. 统计学处理
  • 实验结果
  • 1. 显微镜下观察静水压对髓核细胞形态的影响
  • 2. 髓核细胞成活率检测结果
  • 3. 髓核细胞Alcian blue染色结果
  • 讨论
  • 小结
  • 参考文献
  • 第四部分 静水压下芹菜素对人髓核细胞凋亡率及基质金属蛋白酶代谢的影响
  • 引言
  • 材料和方法
  • 1. 实验材料
  • 1.1 主要实验试剂
  • 1.2 主要实验仪器及用品
  • 2. 实验方法
  • 2.1 实验对象:髓核细胞的传代、爬片和增殖
  • 2.2 干预药物（芹菜素、SNAP）溶液的制备及浓度调整
  • 2.3 静水压加载大小及作用时间选择
  • 2.4 实验分组
  • 2.5 髓核细胞凋亡率检测方法
  • 2.6 髓核细胞MMP-3及TIMP-1表达免疫组织化学染色法检测
  • 2.7 髓核细胞Ⅱ型胶原表达的免疫组织化学染色法检测
  • 3. 统计学处理
  • 实验结果
  • 1. 静水压下各实验组髓核细胞凋亡率检测结果
  • 2. 静水压下各实验组髓核细胞MMP-3及TIMP-1表达情况
  • 3. 静水压下各实验组髓核细胞Ⅱ型胶原表达情况
  • 讨论
  • 结论
  • 课题创新点
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简历

    • 相关论文文献

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