论文摘要
凋亡是多细胞生物体维持正常发育和正常稳态的关键。细胞内存在着两条主要的凋亡通路:细胞表面死亡受体介导的“外源性凋亡通路”和由线粒体介导的“内源性凋亡通路”。细胞在多种应激作用下往往会启动内源性凋亡通路,引发随后的细胞死亡。细胞色素c（Cytochrome c,Cyt C）和其他促凋亡因子从线粒体向胞浆的释放是内源性凋亡通路中关键的控制因素。应激引起细胞内DNA损伤和蛋白质变性的同时,细胞内的保护机制启动,许多蛋白分子参与其中,包括热休克蛋白（heat shock protein,HSP）。葡萄糖调节蛋白75（glucose-regulated protein 75,Grp75）是HSP70家族成员之一,具有多种功能包括线粒体输入、胞内运输及调控细胞增殖和分化等。此外,越来越多的证据表明在多种应激引起的细胞损伤过程中,Grp75起到了一定的保护作用。本实验室先前的研究发现过表达Grp75能降低缺糖诱导的PC12细胞损伤,但详细机制并不清楚。有研究证实Grp75过表达可以抑制某些应激引发的细胞凋亡,那么Grp75保护细胞免受缺糖诱导的损伤是否与其抗凋亡机制有关?Annexin V/PI双染法和凋亡细胞形态学检测结果均显示Grp75过表达抑制了缺糖诱导的PC12细胞凋亡。Cyt C免疫荧光结果则提示Grp75对凋亡的抑制通过其对CytC释放的调控。Bcl-2家族成员是调节内源性凋亡通路的线粒体上游分子,可以通过控制CytC的释放影响凋亡的进程。Bcl-2是Bcl-2家族中重要的抗凋亡蛋白,其表达增高能阻止Cyt C的释放,而促凋亡蛋白Bax表达增加或构象改变能促进Cyt C的释放。本实验通过实时定量RT-PCR和免疫印迹检测了Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表达水平的变化,结果显示Grp75过表达轻微抑制了缺糖诱导的Bcl-2表达的降低和Bax/Bcl-2比值的升高。然而与凋亡发生时间相比较,认为Grp75这种作用可能不是其抑制内源性凋亡通路的主要原因。免疫印迹和PCR均未检测到缺糖状态下两组细胞中Bax表达水平的改变。而构象特异性的Bax（6A7）抗体免疫细胞化学结果显示Grp75过表达抑制了缺糖诱导的Bax构象改变。且Bax构象改变早于Cyt C的释放和凋亡发生,具有时间上的一致性,提示Grp75过表达对凋亡的抑制和Cyt C释放的延迟与其阻止Bax构象改变有关。Bcl-2家族成员往往是已激活信号通路的下游靶分子,因此通过免疫印迹、免疫荧光和凋亡相关指标的检测探讨了两条促存活信号通路Raf/Mek/Erk和PI3K/Akt在Grp75抑制Bax构象改变,延迟Cyt C释放过程中所发挥的作用。结果显示Grp75通过对Raf/Mek/Erk信号通路和PI3K蛋白分子活化状态的维持抑制Bax构象改变和凋亡。由于这两条信号通路在激酶级联传递的多个水平上存在着交互作用,为此分析了Grp75保护细胞免受缺糖诱导损伤过程中,两个通路间存在的可能联系。结果发现在缺糖状态下,PI3K特异性抑制剂LY294002处理后的Grp75过表达细胞中Akt被再次激活;而Mek 1/2特异性抑制剂U0126处理后Akt磷酸化水平显著降低。上述结果提示缺糖状态下Grp75通过Raf/Mek/Erk途径激活Akt。Grp75具有分子伴侣活性,能通过阻止应激引起的蛋白质错误折叠和聚集发挥其关键的保护作用。通过免疫共沉淀检测了Grp75与PI3K/Akt、Raf/Mek/Erk通路中的关键效应分子Akt和Erk1/2直接结合情况。结果未发现Grp75和Akt间的结合,提示缺糖状态下Grp75对Akt的激活不依赖于二者的直接相互作用。而Grp75和Erk1/2在正常培养和缺糖培养状态下均有物理性结合,可能与Erk1/2正常构象的维持有关,有待于进一步研究。综上所述,缺糖状态下Grp75通过Raf/Mek/Erk途径激活Akt,并通过对PI3K活性的维持增强促存活信号,随后活化的Akt与Erk1/2通过作用于各自的下游靶分子,共同抑制Bax构象改变,延迟Cyt C释放和凋亡。