论文摘要
临床上由于各种原因（包括创伤或肿瘤等）造成的骨缺损非常常见,其修复一直是医学界的棘手问题。近年来骨组织工程学的创立和发展为骨缺损的修复提供了一条新的途径。骨组织工程需要满足三个基本要素:种子细胞、生长和分化因子和细胞外基质支架。种子细胞是组织工程骨构建及应用研究中的首要环节和基本要素,是保证骨组织工程学持续性深入研究的前提,理想种子细胞的获取至关重要。本试验通过比较三种不同来源大鼠成骨细胞的增殖和成骨活性,从而为骨组织工程种子细胞的选择提供更多的科学参考依据。目的:1.建立从成年大鼠骨髓、骨膜及新生大鼠颅骨组织中体外分离培养大鼠成骨细胞的模式;2.对来源于成年大鼠骨髓、骨膜及新生大鼠颅骨组织的三种成骨细胞进行连续观察,进一步了解其生物学特性;3.比较颅骨、骨膜、骨髓来源的三种成骨细胞的增殖和成骨活性。方法:1.分别从成年大鼠骨髓、骨膜及新生大鼠颅骨组织中分离出骨髓基质细胞（marrow stromal cells,MSCs）、骨膜成骨细胞（periosteal osteoblast,POB）和颅骨成骨细胞（cranial osteoblast,COB）。原代培养时,MSCs采用密度梯度离心与贴壁培养相结合的方法纯化培养,POB和COB分别采用组织块培养法、酶消化培养法和酶消化—组织块联合培养法三种方法对比培养。在传代培养过程中,对MSCs利用地塞米松10-8M,维生素C50μg/ml和β-甘油磷酸钠10mM进行体外联合成骨诱导培养;对POB和COB采用“差速黏附法”进行纯化培养。试验用细胞均为三种不同来源成骨细胞的第三代细胞;2.利用倒置相差显微镜连续观察体外培养的MSCs、POB和COB三种细胞的形态学变化和生物学特性;3.采用MTT法和检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）活性相结合的方法比较三种细胞的增殖活性;4.通过检测成骨活性标志物碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）和骨钙素（osteocalcin,OCN）,考察三种细胞的成骨活性。结果:1.形态学观察:三种不同来源的大鼠成骨细胞分别培养至第三代时,增殖速度较原代加快,大约在培养24h后即可贴壁、伸展,细胞形态比较均一,呈梭形或多角形,并可见“伪足”伸出。随着培养时间的延长,细胞数目不断增多,细胞彼此间融合,并向多层发展,同时细胞外基质分泌增多,并包裹细胞,继而形成团块,透光性逐渐减弱,最终形成钙结节;2.增殖活性比较:MTT结果显示MSCs在第4天时开始倍增,进入快速增殖期,到第7天时增殖速度减慢,步入生长的平台期;COB在第6天开始倍增,到第9天以后增殖速度减慢,进入生长平台期;POB在第7天开始倍增,以后增殖速度明显减慢;LDH结果表明三种细胞在培养至4天、7天和14天时,MSCs的LDH值均明显高于后二者（p＜0.05）,COB与POB的LDH值在7天时差距最明显（p＜0.05）,即COB的LDH值明显高于POB,在4天和14天时二者差距相对较小（p＞0.05）,无统计学意义;3.成骨能力比较:ALP检测结果表明三种细胞在培养至1周、2周和3周时,POB的ALP值均高于MSCs和COB,其中2、3周时POB的ALP值与MSCs、COB比较有统计学差异（p＜0.05）,在第1周时MSCs的ALP值与后二者差距较大（COB值高于其82.39%,POB值高于其109%）,随着培养时间的延长,与二者差距逐渐缩小;OCN检测结果显示三种细胞在培养至1周、2周和3周时,MSCs的骨钙素含量始终低于后二者（p＜0.05）,且有随着培养时间的延长差距加大的趋势,而COB和POB的OCN含量的差距在第2周时表现的最明显（p＜0.05）,在1、3周时差距相对较小（p＞0.05）,无统计学意义。结论:（1）采用酶消化—组织块联合培养法获取颅骨、骨膜来源的成骨细胞并进行培养以及通过密度梯度离心与贴壁培养相结合的方法获取骨髓基质干细胞进行诱导培养,均可得到均一性好、活性强的大鼠成骨细胞;（2）培养的颅骨、骨膜来源的成骨细胞和在诱导培养下的骨髓基质细胞具有成骨细胞的形态特征,经两次以上传代后三种细胞在形态上无明显的差别;（3）三种不同来源的大鼠成骨细胞的增殖活性依次为:MSCs＞COB＞POB;（4）三种不同来源的大鼠成骨细胞的成骨活性依次为:POB＞COB＞MSCs。