甜菜碱对肥育猪脂肪代谢及其关键酶基因表达的影响与机理研究

论文摘要

本课题以肥育猪为试验对象，通过饲养试验、屠宰试验、肝细胞体外培养，从生理生化、脂肪代谢相关的酶活性和部分关键酶（脂肪酸合成酶、线粒体肉碱脂酰转移酶Ⅰ）基因表达变化、生长激素脉冲分泌模式及其它相关激素水平等方面探讨了甜菜碱对肥育猪脂肪代谢的影响，旨在阐明甜菜碱改善肥育猪胴体组成的机理，为甜菜碱作为新型的营养再分配剂在养猪业上的应用提供科学依据。根据Genebank登录的猪脂肪酸合成酶（FAS）、肝型肉碱脂酰转移酶Ⅰ（L-CPTⅠ）、肌肉型肉碱脂酰转移酶Ⅰ（M-CPTⅠ）和内标β-actin基因序列设计引物，分别以皮下脂肪组织、肝脏和背最长肌mRNA为模板，经反转录和PCR反应，克隆得到了相应的FAS、L-CPTⅠ、M-CPTⅠ及内标β-actin的基因片断。对测序结果进行序列分析表明，得到的FAS、L-CPTⅠ、M-CPTⅠ及内标β-actin基因序列与Genebank登录的相应基因片断（登录号分别为AY183428、AF288789、AY181062和U07786）同源性分别为98.77％、99.59％、99.61％和99.27％。在此基础上，进一步探讨了PCR反应中适宜的退火温度、Mg2+浓度和循环次数，构建了适合相应基因序列的优化半定量RT-PCR法，以用于研究甜菜碱对肥育猪皮下脂肪组织FAS基因、肝脏和肌肉CPTⅠ基因mRNA表达量的影响。48头体重55kg左右的“杜洛克×斯格（15系×12／36系）”杂交肥育猪，按试验要求分成2组，每组设3个重复，每个重复8头，公母各半，分别饲喂添加0或1250mg／kg盐酸甜菜碱（以纯品计）的玉米-豆粕型饲粮。试验预试期7d，正验期42d。饲养期间，试验猪自由采食、饮水。饲养试验结束后，从试验组和对照组的每个重复中各选取体重90kg左右的试验猪2头（公母各半），共12头，饲喂相应饲料，1h后，分别耳静脉采血，试验于13：00至16：00，每隔15min采样一次，并分别制各血清，以研究甜菜碱对肥育猪生长激素（GH）脉冲分泌的影响。按常规方法进行屠宰，测定胴体组成，并采集血清、肝脏、肌肉和皮下脂肪样品，进行相关指标分析。肝细胞体外培养试验设终浓度为1 mmol／L肉碱、2 mmol／L甜菜碱、4 mmol／L甜菜碱、1 mmol／L肉碱+2 mmol／L甜菜碱、1 mmol／L肉碱+4 mmol／L甜菜碱及空白对照6个处理，每个处理设3个重复，分别测定培养48、96h时肝细胞线粒体CPTⅠ活性。饲养试验结果表明：添加甜菜碱（1250 mg／kg）使肥育猪日增重提高了5.5％（P＜0.05），采食量无显著影响（P＞0.05），料重比呈降低趋势（P＞0.05）。屠宰试验结果显示：添加甜菜碱（1250 mg／kg）明显改善了肥育猪的胴体组成，胴体瘦肉率提高了5.2％（P＜0.01），眼肌面积增大了17.6％（P＜0.01），胴体脂肪率和平均背膘厚分别降低了13.1％（P＜0.01）和10.3％（P＜0.05）。甜菜碱对肥育猪屠宰率、皮肤比率、骨骼比率、板油重无显著影响（P＞0.05）。肝脏和背最长肌样品分析表明：①添加甜菜碱（1250 mg／kg），肥育猪背最长肌粗脂肪含量提高了23.6％（P＜0.05），肝脏粗脂肪含量呈下降趋势（P＞0.05）。甜菜碱对肥育猪肝脏和背最长肌粗蛋白含量无显著影响（P＞0.05）。②甜菜碱使肥育猪肝脏游离肉碱含量、背最长肌酸不溶肉碱含量分别提高了19.5％（P＜0.05）和45.6％（P＜0.01）。而且，甜菜碱显著降低了肥育猪背最长肌线粒体CPTⅠ活性及其mRNA表达，两者分别降低了11.1％（P＜0.05）和14.6％（P＜0.05）。但甜菜碱对肝脏线粒体CPTⅠ活性及其mRNA表达未产生显著影响（P＞0.05）。另外，肥育猪肝脏和背最长肌线粒体CPTⅠ活性与CPTⅠmRNA表达量之间具有较好的相关性（相关系数分别为0.67和0.72，P＜0.05）。脂肪样品分析显示：添加甜菜碱（1250 mg／kg）使肥育猪皮下脂肪组织脂肪生成酶、激素敏感脂酶、脂蛋白脂酶活性发生了显著变化。与对照组相比，试验组皮下脂肪组织激素敏感脂酶活性提高了15.1％（P＜0.05），FAS、乙酰-CoA羧化酶、苹果酸脱氢酶及脂蛋白脂酶的活性分别降低了18.8％（P＜0.05）、18.0％（P＜0.01）、14.5％（P＜0.05）和8.9％（P＜0.05），葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶的活性呈下降趋势（P＞0.05）。而且，甜菜碱使肥育猪皮下脂肪FAS mRNA表达降低了25.0％（P＜0.05），FAS活性和FAS mRNA表达量之间具有较好的相关性（相关系数为0.93，P＜0.01）。另外，甜菜碱使肥育猪皮下脂肪cAMP含量提高了23.4％（P＜0.05）。生长激素脉冲分泌特点分析表明：添加甜菜碱（1250 mg／kg）显著提高肥育猪GH分泌的基础水平、总体水平和峰强度，分别比对照组提高了41.8％（P＜0.01）、49.0％（P＜0.01）和35.1％（P＜0.05）。甜菜碱对肥育猪GH分泌频率和峰持续时间未产生显著影响（P＞0.05）。血清指标分析显示，添加甜菜碱（1250 mg／kg）明显提高了肥育猪血清胰岛素样生长因子-Ⅰ、胰岛素、游离三碘甲腺原氨酸、游离四碘甲腺原氨酸和促甲状腺激素的水平，分别比对照组提高了55.5％（P＜0.01）、42.3％（P＜0.05）、58.0％（P＜0.01）、51.8％（P＜0.01）和49.7％（P＜0.01）。甜菜碱使肥育猪血清总蛋白、游离脂肪酸含量和脂肪酶活性分别提高了8.8％（P＜0.05）、25.7％（P＜0.01）和22.6％（P＜0.01），血清尿素氮含量降低了21.6％（P＜0.01），但对血清其它生化指标无显著影响（P＞0.05）。细胞培养试验结果显示：2 mmol／L、4 mmol／L甜菜碱对培养48 h、96 h的猪原代肝细胞线粒体CPTⅠ活性无显著影响（P＞0.05），1 mmol／L肉碱、肉碱+甜菜碱显著提高了CPTⅠ活性（P＜0.01）；与1 mmol／L肉碱处理组相比，肉碱+甜菜碱对CPTⅠ活性的影响不明显（P＞0.05）；经甜菜碱、肉碱处理的CPTⅠ活性在96 h时比48 h时高（P＜0.05）。本研究结果提示：甜菜碱可显著提高肥育猪胴体瘦肉率和眼肌面积，降低胴体脂肪率和背膘厚，并可促进肥育猪的生长；甜菜碱可显著提高猪血清GH水平，影响GH脉冲分泌幅度；甜菜碱似通过影响猪体内GH、胰岛素样生长因子-Ⅰ、游离三碘甲腺原氨酸、游离四碘甲腺原氨酸、促甲状腺激素及胰岛素水平，降低皮下脂肪组织脂肪生成酶的活性和基因表达（如FAS mRNA表达），提高皮下脂肪组织激素敏感脂酶活性和血清脂肪酶、游离脂肪酸水平，调节肥育猪脂肪的合成与分解代谢，并通过提供肉碱合成所必需的甲基来提高肝脏游离肉碱和肌肉组织酸不溶肉碱的含量，降低肌肉线粒体CPTⅠ活性和CPTⅠmRNA表达，在减少体脂沉积（主要是皮下脂肪）同时，适度增加肌肉脂肪含量，从而发挥降低和重新分配体脂的作用。

论文目录

• 主要英文缩略词
• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 猪脂肪代谢及其调控研究进展
• 1.1 脂肪组织发育规律
• 1.2 脂肪的合成与分解及其转运
• 1.2.1 脂肪的合成
• 1.2.2 脂肪的分解、氧化及其转运
• 1.3 脂肪代谢的调控
• 1.3.1 遗传选育
• 1.3.2 激素对脂肪代谢的调控
• 1.3.3 营养调控
• 1.3.4 免疫调控
• 第二章 甜菜碱在养猪生产中的应用研究进展
• 2.1 甜菜碱的理化性质
• 2.2 甜菜碱在动物体内的代谢
• 2.3 甜菜碱的功能
• 2.3.1 甜菜碱的转甲基作用
• 2.3.2 甜菜碱调节渗透压的作用
• 2.3.3 甜菜碱的诱食作用
• 2.3.4 甜菜碱的抗应激作用
• 2.3.5 甜菜碱对维生素的稳定作用
• 2.4 甜菜碱在养猪生产中的应用
• 2.4.1 甜菜碱对猪生长性能的影响
• 2.4.2 甜菜碱对猪胴体组成的影响
• 2.4.3 甜菜碱对肉质的影响
• 2.4.4 甜菜碱对（早期）断奶仔猪腹泻的影响
• 2.4.5 甜菜碱对（妊娠）母猪繁殖性能的影响
• 2.5 甜菜碱的作用机理
• 2.5.1 甜菜碱与蛋白质、氨基酸代谢
• 2.5.2 甜菜碱与脂肪代谢
• 2.5.3 甜菜碱对生长调控轴激素的影响
• 2.5.4 甜菜碱与猪肉品质
• 2.5.5 甜菜碱与营养物质消化吸收
• 第三章 本研究的目的、意义及主要内容
• 第二篇 试验研究
• 第四章 FAS、L-CPT I、M-CPT I 和 β-actin 基因片断的克隆
• 4.1 基因克隆策略
• 4.2 试验材料
• 4.2.1 动物材料
• 4.2.2 菌种与载体
• 4.2.3 仪器设备和试剂
• 4.2.4 引物
• 4.2.5 培养基及主要试剂的配制
• 4.3 试验方法
• 4.3.1 总 RNA 的提取
• 4.3.2 RNA 含量的测定
• 4.3.3 反转录
• 4.3.4 PCR 反应
• 4.3.5 PCR 产物电泳，检测目的条带是否与设计大小相符
• 4.3.6 PCR 产物的割胶回收
• 4.3.7 割胶回收的 PCR 产物与 pUCm-T Vector 连接
• 4.3.8 感受态细胞的制备与目的 DNA 的热激转化
• 4.3.9 重组克隆的筛选、重组质粒的提取与鉴定
• 4.3.10 重组 DNA 核苷酸序列测定分析
• 4.4 试验结果
• 4.4.1 FAS、L-CPT I、M-CPT I 和 β-actin 基因 RT-PCR 产物电泳结果
• 4.4.2 PCR 产物克隆及重组质粒鉴定
• 4.4.3 重组质粒测序结果
• 4.5 讨论
• 第五章 半定量 RT-PCR 法测定 FAS、L-CPT I 和 M-CPT I mRNA 丰度的条件优化
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 动物材料
• 5.1.2 仪器设备和试剂
• 5.1.3 主要试剂的配制
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 总 RNA 的提取
• 5.2.2 RNA 含量的测定
• 5.2.3 反转录
• 5.2.4 PCR 反应
• 5.2.5 琼脂糖凝胶电泳
• 5.3 试验结果
• 2+ 浓度对 FAS、L-CPT I、M-CPT I 和 β-actin 基因扩增效率的影响'>5.3.1 Mg²⁺ 浓度对 FAS、L-CPT I、M-CPT I 和 β-actin 基因扩增效率的影响
• 5.3.2 循环数对 FAS、L-CPT I、M-CPT I 和 β-actin 基因扩增效率的影响
• 5.4 讨论
• 第六章 饲养试验和屠宰试验
• 6.1 试验材料
• 6.2 试验方法
• 6.2.1 饲养试验
• 6.2.2 动态采血
• 6.2.3 屠宰试验
• 6.2.4 样品收集与保存
• 6.2.5 肝脏和背最长肌粗蛋白、粗脂肪含量的测定
• 6.2.6 肝脏和背最长肌游离肉碱、酸不溶肉碱含量的测定
• 6.2.7 肝脏和背最长肌线粒体 CPT I 活性的测定
• 6.2.8 肝脏和背最长肌线粒体 CPT I mRNA 丰度的测定
• 6.2.9 皮下脂肪激素敏感脂酶活性的测定
• 6.2.10 皮下脂肪脂蛋白脂酶活性的测定
• 6.2.11 皮下脂肪 NADPH 生成酶活性的测定
• 6.2.12 皮下脂肪乙酰-CoA 羧化酶活性的测定
• 6.2.13 皮下脂肪 FAS 活性的测定
• 6.2.14 皮下脂肪 FAS mRNA 丰度的测定
• 6.2.15 血清生化指标的测定
• 6.2.16 血清激素水平的测定
• 6.2.17 皮下脂肪 cAMP 含量的测定
• 6.2.18 统计分析
• 6.3 试验结果
• 6.3.1 生长性能
• 6.3.2 胴体组成
• 6.3.3 内脏器官相对重量
• 6.3.4 肝脏和背最长肌粗蛋白、粗脂肪含量
• 6.3.5 肝脏和背最长肌游离肉碱、酸不溶肉碱含量及其比值
• 6.3.6 肝脏和背最长肌线粒体 CPT I 活性
• 6.3.7 肝脏和背最长肌线粒体 CPT I mRNA 丰度
• 6.3.8 血清甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸含量及脂肪酶活性
• 6.3.9 皮下脂肪激素敏感脂酶和脂蛋白脂酶活性
• 6.3.10 皮下脂肪组织脂肪生成酶活性
• 6.3.11 皮下脂肪 FAS mRNA 丰度
• 6.3.12 生长激素脉冲分泌模式及其特征
• 6.3.13 血清激素水平
• 6.3.14 皮下脂肪 cAMP 含量
• 6.3.15 血清其它生化指标
• 6.4 讨论
• 6.4.1 甜菜碱对肥育猪生长性能的影响
• 6.4.2 甜菜碱对肥育猪胴体组成和内脏器官的影响
• 6.4.3 甜菜碱对肥育猪蛋白质代谢的影响
• 6.4.4 甜菜碱对肥育猪脂肪代谢的影响及其调控机理
• 6.4.5 甜菜碱对肥育猪生长激素脉冲分泌模式的影响
• 6.4.6 甜菜碱对肥育猪 IGF-I 分泌的影响
• 3、FT₄ 和胰岛素分泌的影响'>6.4.7 甜菜碱对肥育猪 TSH、FT₃、FT₄和胰岛素分泌的影响
• 6.4.8 其它
• 第七章 细胞培养试验
• 7.1 试验材料
• 7.1.1 仪器设备和试剂
• 7.1.2 试剂的配制
• 7.2 试验方法
• 7.2.1 试验取材
• 7.2.2 猪原代肝细胞的分离获取
• 7.2.3 试验分组
• 7.2.4 取样及指标测定
• 7.2.5 统计分析
• 7.3 试验结果
• 7.3.1 生化指标
• 7.3.2 CPT I 活性
• 7.4 讨论
• 7.4.1 肝细胞的分离方法
• 7.4.2 原代培养肝细胞的活性分析
• 7.4.3 甜菜碱对原代培养猪肝细胞线粒体 CPT I活性的影响
• 第三篇 提示及创新点
• 提示
• 创新点
• 参考文献
• 攻博期间发表的与学位论文相关的文章
• 致谢