论文摘要
研究背景体外受精-胚胎移植技术开展至今已30年,到目前为止全世界范围内已出生辅助生育技术（assisted reproductive technology,ART）子代约3,000,000,这些子代代表了人口的一个重要组成部分。已有报道提示在ART子代中健康风险增加,包括自然流产、低体重、极低体重、小于胎龄儿、出生缺陷、脑瘫等,原因尚不明确。ART子代基因组表达的整体状况如何,与自然受孕子代的基因组表达谱有无差别,有多大差别,其表达改变主要源自于基因序列变化抑或表观遗传修饰的变化,受影响的基因主要包括哪些,目前皆缺少相关研究和评估。该状况明显滞后于人们对ART安全性问题日益增长的关注程度,也将会明显影响ART在人类生殖健康方面应有作用的充分发挥和完善,因此对ART子代安全性进行系统性研究,深入探究健康高风险原因迫在眉睫。近年来印迹缺陷,包括Beckwith-Wiedemann综合征（Beckwith-Wiedemannsyndrome,BWS）、Angelman综合征（Angelman syndrome,AS）引起了人们的广泛关注。多项病例对照研究提示在ART子代中印迹缺陷风险增加。印迹基因等位基因特异性表达的破坏与人类遗传疾病、某些肿瘤及神经系统疾病相关,其亲缘特异性表达需要正常水平的DNA甲基化。印迹基因的甲基化在配子发生过程中擦除并重新建立,在种植前后维持甲基化,而ART技术在配子发生、受精及种植前后阶段操作配子和胚胎,这一时期恰恰是印迹基因甲基化重新编程的关键时期,因此可能导致印迹基因甲基化异常。目前ART操作与印迹基因印迹状态的关系尚未明确。动物买验提不操作及体外培养胚胎可能破坏基因组印迹,而且在配子形成过程中发生的表观遗传改变在种植后发育过程中不能纠正,可能与印迹基因表达异常及表型异常相关。但是,人类研究未发现可检测的印迹基因表达异常,提示配子形成过程中建立的印迹在ART过程中稳定保持。目前可获得的有关ART与基因印迹疾病相关性的人类研究信息多来自ART子代出生后单个或几个印迹基因检测的报道,缺少大样本ART子代基因组印迹整体状况及其改变的研究资料,有必要对ART子代印迹状态进行系统性研究。本研究首先通过染色体核型和微缺失检测评估ART子代基因突变的风险。然后通过affymetrix全基因组表达芯片及荧光定量PCR进行全基因组表达谱和印迹基因的mRNA总表达水平的检测以评估ART子代mRNA表达异常的风险。并进一步以ART子代中表达异常的印迹基因作为候选基因,检测候选基因的单等位表达,研究DNA甲基化与印迹稳定性的关系。从而在基因序列、基因表达及表观遗传修饰三个层面全面、系统地评估ART子代基因组学安全性。第一部分辅助生育技术出生子代基因突变的检测目的:研究无遗传学高风险的ART男性子代中染色体异常和Y染色体微缺失发生情况,从而反映ART子代发生基因突变的风险。材料与方法:收集我院出生的ART男性子代脐血37例,包括19例IVF子代及18例ICSI子代,以同期在我院分娩的60例自然妊娠男性子代为对照,采集脐血行染色体核型分析和Y染色体微缺失检测,并对其父代进行相应检测,数理统计分析。结果:自然妊娠子代及ART子代中均未发现染色体核型异常。37例ART子代中发现4例（10.8%）Y染色体微缺失,其中19例IVF子代中1例（5.3%）,18例ICSI子代中3例（16.7%）,ART子代中微缺失发生率显著高于自然妊娠子代,P＜0.05。微缺失子代的父代均未发现微缺失。1例存在Y染色体微缺失的ART子代合并尿道下裂。结论:父代遗传学背景正常的ART男性子代Y染色体de novo微缺失风险较自然妊娠子代显著增高,提示ART子代中基因突变的风险较自然妊娠子代中增加,可能与ART技术相关,需密切关注ART子代遗传学安全性,进一步深入研究其机制及影响面,采取适当措施控制其发生。第二部分辅助生育技术子代全基因组表达谱及印迹基因表达状况目的:研究ART子代中基因表达谱与自然妊娠子代是否存在差异,阐明其差异程度及主要方面,同时分析ART子代中印迹基因的表达差异,并筛选关键性的差异基因。材料与方法:应用Affymetrix公司的Human Genome U133 Plus 2.0芯片,对ART子代和自然妊娠子代各8例进行检测,利用芯片显著性分析（significance analysisof microarray,SAM）比较两组标本基因表达,采用分层聚类、GO（gene ontology）分类及信号通路（Pathway）分析对差异表达基因进行数据分析。收集我院出生的ART子代及自然妊娠子代脐血各40例,对关键性差异表达基因及可能存在表达差异的印迹基因行荧光定量RT-PCR检测。结果:采用SAM法得到两组间差异最为显著的159个基因,对差异基因进行无监督的分层聚类,可完全区分ART子代和自然妊娠子代。GO分析显示差异基因中包括与生长和发育相关的基因。Pathway分析发现8条信号通路差异变化有显著性,包括Toll样受体信号通路等。荧光定量PCR检测8个非印迹基因和9个印迹基因在ART子代和自然妊娠子代中的表达情况,发现6个非印迹基因和3个印迹基因的表达在两组间存在显著性差异。结论:部分基因在ART子代中表达改变,其中与生长发育相关的基因在ART子代中表达降低,可能为ART子代低体重的一个机制。ART子代中印迹基因总的表达状况与自然妊娠子代相似,仅3个印迹基因在ART子代中表达改变,即PEG10和L3MBTL表达上调,PHLDA2表达下调。第三部分辅助生育技术出生子代印迹基因PEG10、L3MBTL及PHLDA2的印迹状况目的:研究ART子代脐血中PEG10、L3MBTL及PHLDA2的等位基因表达状况,探讨ART子代中印迹状态异常的风险。材料与方法:以60例ART子代为研究组,20例自然妊娠子代为对照,采用PCR直接测序及RT-PCR直接测序对PEG10、L3MBTL及PHLDA2的等位基因表达进行检测。结果:在自然妊娠子代中未发现印迹丢失情况。在ART子代中存在印迹丢失,其中,7例ART子代中存在PEG10基因印迹丢失,发生率为31.8%（7/22）,1例ART子代中存在L3MBTL基因印迹丢失,发生率为5.56%（1/18）。PHLDA2基因在ART子代及自然妊娠子代脐血中均为双表达。结论:小部分ART子代脐血中印迹基因PEG10和L3MBTL的单等位表达被破坏,提示ART子代中印迹状态的不稳定性。第四部分辅助生育技术出生子代印迹基因PEG10及L3MBTL的甲基化状况目的:研究ART子代中印迹基因PEG10和L3MBTL CpG岛的甲基化状况,评估ART子代中甲基化异常的风险,探索印迹丢失与CpG岛甲基化的关系。材料与方法:以4例ART子代和2例自然妊娠子代为研究对象,采用亚硫酸氢盐测序的方法检测PEG10和L3MBTL的CpG岛的甲基化状态。结果:在自然妊娠子代及ART子代中PEG10启动子区的22个CpG位点基本未发生甲基化,两组标本间PEG10的甲基化状况相似。L3MBTL基因在自然妊娠子代中所有CpG位点均为中等甲基化,而在部分ART子代中CpG岛的甲基化程度较自然妊娠子代降低,在一例ICSI子代中所有CpG位点均为非甲基化,该子代印迹丢失。结论:部分ART子代中L3MBTL差异甲基化区CpG岛甲基化水平较自然妊娠子代降低,CpG岛低甲基化为L3MBTL印迹丢失的潜在机制之一。结论本研究首次证明了ART子代脐带血中部分基因序列、表达的改变及部分印迹基因亲缘特异性表达的不稳定性,提示ART可能影响基因的序列、表达,破坏印迹的建立与维持。尽管ART子代基因序列、表达改变及表观遗传不稳定性的具体机制、相关表型尚不明确,本实验描绘了ART子代全基因组表达谱及印迹基因表达的总体情况,为进一步研究提供了依据及基础。
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