BCG活化小鼠巨噬细胞膜蛋白质组的生物信息学分析及相关分子INATase的初步研究

论文摘要

为了发掘出在活化巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的过程中,发挥主要介导作用的效应分子,我们利用质谱技术分别对BCG活化和TGC诱导的小鼠巨噬细胞膜蛋白进行了鉴定。通过对两组蛋白的比较和分析,我们得到了421个差异表达在BCG活化巨噬细胞的膜蛋白。然后,我们按照GO分类标准对各个蛋白分子的功能预测进行了注释,其中42个成员被鉴定为亚细胞定位在细胞质膜上的膜蛋白。其余分子功能分布广泛,从细胞组成到代谢组分等等。我们进而对所鉴定出的差异性膜蛋白进行了生物信息学分析。通过聚类分析、表达模式分析及表达模式关系预测等研究手段,我们发现,这些分子中的大部分,在巨噬细胞中的表达水平都随着活化时间的延长表现出上调表达的趋势。并且,这些蛋白相互间的表达模式相关性非常复杂,几乎每一种蛋白的表达变化都与多种其它蛋白的表达变化紧密相关。本研究鉴定出的大量活化相关蛋白分子,为深入研究巨噬细胞活化机制及肿瘤细胞杀伤机制积累了必要的数据资料。作为下一阶段对目标蛋白进行功能研究的初始阶段,我们选取了一个全新蛋白INATase。通过构建其重组表达载体,我们获得了一定量的重组蛋白,并制备了兔血清多克隆抗体。为了检测这一蛋白在活化巨噬细胞中的表达情况,我们进行了活化巨噬细胞的免疫组织化学鉴定,初步证实了INATase在活化巨噬细胞中的存在。为下一步进行活化巨噬细胞功能机制的研究奠定了一定的基础。对于活化巨噬细胞的基因水平变化,已有相关的研究结果。本研究首次从转录水平和蛋白质组水平两个方面对巨噬细胞活化过程中的大分子变化进行了分析和研究,鉴定出相当数量的膜蛋白分子,进一步丰富了巨噬细胞膜蛋白数据库,并成功获得了一个有潜在研究价值的重组蛋白。本研究不但为巨噬细胞接触依赖性杀伤机制及巨噬细胞活化的研究提供了大量非常有价值的资料,而且为后续工作提供了一种可靠的研究思路和可行的研究模式。

论文目录

• 提要
• 英文缩写对照表
• 前言
• 第一章 文献回顾
• 1. 巨噬细胞的活化
• 1.1 巨噬细胞激活剂
• 1.2 活化巨噬细胞的类型及其功能
• 2. 活化巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的机制
• 2.1 肿瘤细胞的识别过程
• 2.2 巨噬细胞介导的细胞毒作用
• 2.3 抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）
• 3. 活化巨噬细胞在肿瘤治疗中的作用
• 3.1 体内激活巨噬细胞治疗肿瘤
• 3.2 过继性的细胞免疫治疗法治疗肿瘤
• 4. 活化巨噬细胞蛋白质组学和生物信息学相关研究进展
• 5. 本课题立题依据和研究内容
• 5.1 立题依据
• 5.2 课题特色
• 第二章 材料与方法
• 1. 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 细胞株
• 1.3 质粒和菌株
• 1.4 主要试剂
• 1.5 主要仪器
• 1.6 溶液
• 1.7 辅助工具
• 2. 方法与步骤
• 2.1 活化巨噬细胞膜蛋白的分离与鉴定
• 2.2 BCG活化的巨噬细胞差异表达膜蛋白的生物信息学分析
• 2.3 INATase设计及构建
• 2.4 INATase的诱导表达和纯化
• 2.5 INATase的膜定位研究
• 第三章 实验结果
• 1. 活化巨噬细胞膜蛋白的分离与质谱分析
• 2. BCG活化的巨噬细胞差异性蛋白的生物信息学分析
• 2.1 差异性表达膜蛋白的筛选和功能分类
• 2.2 差异性表达蛋白的亚细胞定位及蛋白间相互作用关系预测
• 2.3 BCG活化巨噬细胞差异性表达膜蛋白的基因表达数据聚类分析
• 2.4 聚类基因表达模式分析
• 2.5 BCG活化巨噬细胞差异性表达膜蛋白的基因表达模式相关性
• 3 INATase的设计及原核表达
• 3.1 INATase的选择和功能预测
• 3.2 INATase的设计
• 3.3 RT-PCR从BCG活化的鼠源巨噬细胞中调取INATase的编码DNA
• 3.4 INATase表达载体的构建及鉴定
• 3.5 测序鉴定INATase-pET28 融合表达载体
• 4. INATase的诱导表达
• 4.1 诱导剂浓度对蛋白表达量的影响
• 4.2 培养时间和温度对蛋白表达量的影响
• 5 INATase的分离纯化
• 5.1 INATase表达形式的鉴定
• 5.2 INATase的分离纯化
• 6. INATase 的细胞定位研究
• 6.1 INATase兔血清多抗的效价检测
• 6.2 INATase在活化巨噬细胞中的表达
• 第四章 讨论
• 1. 活化巨噬细胞与肿瘤杀伤
• 2. 活化巨噬细胞的膜蛋白质组的生物信息学分析
• 3. 活化巨噬细胞膜蛋白的组成
• 3.1 活化巨噬细胞的经典组分
• 3.2 与胞间粘附相关的蛋白
• 3.3 介导细胞-细胞间信号传导功能的相关蛋白
• 3.4 酶
• 3.5 未知功能的蛋白分子
• 3.6 细胞膜蛋白
• 4. 酰基转移酶
• 5. 本课题的研究意义及展望
• 第五章 结论
• 参考文献
• 攻读博士期间发表及待发表的学术论文
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract