适冷海洋青霉纤维素酶和半纤维素酶分子生物学研究

论文摘要

与海洋动物、植物一样，海洋微生物也是一类重要的可再生的海洋自然资源，是丰富的基因库。尤其经过长期环境适应，海洋微生物作为产酶资源具有突出的特点和优势：具有显著的耐压、耐碱、耐盐、耐冷和多物种等特性；代谢易于调控，在低温条件下具有相对较高的活性。这些性质使得低温酶在工业应用和基础研究诸多方面引起浓厚兴趣，从而赋予海洋微生物酶独特的应用前景。 本文从黄海和东海的海底泥样中分离到51株海洋真菌，对其中6株产纤维素酶量较高的菌株进行了较为详细的研究。这6株海洋真菌的最适生长温度均在15-25℃，最高生长温度均不超过37℃。其中一株编号为FS010的菌株的纤维素酶活性最高，对其生长的适冷性和它产生的纤维素酶的冷活性进行了研究。另对其培养条件及影响产酶的因素也进行了分析，得到最优化的产酶培养基。 FS010菌株的最适生长温度为15℃，最高生长温度不超过37℃，在0℃也能够正常生长和产生孢子，属于典型的适冷菌。其最适产酶温度为15℃，在液体发酵培养基中培养3d，纤维素酶活力达到23.6U／ml。显微镜下观察发现FS010菌株的营养菌丝呈白色，有隔膜，产生青霉特有的帚状分生孢子头，未发现有性孢子，未见孢子囊和子囊壳等特化的细胞和组织体。形态学特征初步鉴定该海洋真菌为青霉。为进一步鉴定FS010菌株，我们通过通用引物PCR克隆了该菌株的18S rDNA基因，扩增长度为1797bp，测序结果分析表明和产黄青霉（Penicillium chrysogenum）KCTC6052的18S rDNA相似性最高，达99.2％。另克隆了该菌株线粒体小亚基rDNA基因，测序结果分析和18S rDNA基因的分析结果一致，因此我们判断适冷海洋青霉FS010属于产黄青霉。 采用生物信息学手段分析了8种丝状真菌外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ（CBHI）序列的保守性，发现CBHI进化具有高度的保守性。根据蛋白保守序列设计兼并引物，PCR扩增得到约1.0kb片段。测序结果显示该片段与构巢曲霉（Aspergillus Nidulans）cbh1相似性最高（79％）。在此基础上，采用热不对称嵌套PCR方法首次克隆了适冷产黄青霉FS010的cbh1基因。该基因含有长1590bp的开放阅读框，编码529个氨基酸，氨基酸序列中含有3个潜在的N-乙酰糖基化位点。对氨基酸序列同源性分析表明该蛋白属于糖苷水解酶第七家族。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.海洋真菌的研究进展
• 1.1 海洋真菌的概述
• 1.2 海洋真菌代谢产物的多样性
• 2 纤维素酶研究进展
• 2.1 纤维素酶概述
• 2.2 外切葡聚糖酶结构和作用机理
• 2.3 外切葡聚糖酶分子生物学研究
• 3.半纤维素酶研究进展
• 3.1 木聚糖酶概述
• 3.2 木聚糖酶分子生物学研究进展
• 4.丝状真菌基因克隆策略
• 4.1 已知基因编码产物基因克隆策略
• 4.2 未知基因编码产物基因克隆策略
• 4.3 电子克隆策略
• 5.丝状真菌基因表达调控
• 5.1 丝状真菌启动子
• 5.2 丝状真菌反式作用因子
• 6.本论文研究工作及意义
• 第二章 适冷海洋真菌的分离及培养条件的优化
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 样品采集
• 2.2.2 菌株和质粒
• 2.2.3 分子克隆用酶及试剂
• 2.2.4 培养基
• 2.2.5 仪器
• 2.2.6 实验方法
• 2.3 结果和分析
• 2.3.1 产纤维素酶低温海洋真菌的分离
• 2.3.2 适冷海洋青霉FS010形态鉴定
• 2.3.3 适冷FS010菌株的分子鉴定
• 2.3.4 适冷产黄青霉FS010产纤维素酶培养条件优化
• 2.3.5 适冷海洋青霉外切葡聚糖酶酶学性质
• 2.4 本章小结
• 第三章 适冷产黄青霉外切葡聚糖酶基因克隆和表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株和质粒
• 3.2.2 分子克隆用酶及试剂
• 3.2.3 培养基组成
• 3.2.4 仪器
• 3.2.5 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 FS010 cbh1基因片段的克隆
• 3.3.2 TAIL-PCR扩增cbh1基因5’端序列
• 3.3.3 TAIL-PCR扩增cbh1基因3’端序列
• 3.3.4 cbh1全长基因的克隆
• 3.3.5 cbh1拷贝数的确定
• 3.3.6 cbh1 cDNA基因克隆
• 3.3.7 氨基酸序列分析与同源性比较
• 3.3.8 外切葡聚糖酶同源模建
• 3.3.9 不同碳源对cbh1表达的影响
• 3.3.10 cbh1 cDNA在酿酒酵母中的组成性表达
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 适冷产黄青霉FS010外切葡聚糖基因上游调控序列的分离及功能性分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌株、质粒和培养基
• 4.2.2 常规的重组DNA技术
• 4.2.3 产黄青霉cbh1启动子的克隆
• 4.2.4 报告质粒pcbh1及缺失报告质粒的构建
• 4.2.5 产黄青霉原生质体制备和转化
• 4.2.6 转化子染色体快速提取
• 4.2.7 转化子PCR验证
• 4.2.8 转化子杂交验证
• 4.2.9 蛋白质含量测定
• 4.2.10 GUS活性测定
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 TAIL-PCR分离cbh1启动子序列
• 4.3.2 cbh1启动子序列功能元件分析
• 4.3.3 FS010 cbh1启动子活性的鉴定
• 4.3.4.启动子的定向缺失分析
• 4.4 本章小结
• 第五章 适冷产黄青霉低温木聚糖酶基因的克隆和表达
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 菌株、质粒
• 5.2.2 试剂
• 5.2.3 常规DNA重组技术
• 5.2.4.FS010低温木聚糖酶基因的克隆
• 5.2.4.FS010低温木聚糖酶cDNA的克隆
• 5.2.5 低温木聚糖酶基因xyl在大肠杆菌的表达和分离纯化
• 5.2.6 蛋白质技术
• 5.2.7 木聚糖酶活性的测定
• 5.3 结果和讨论
• 5.3.1 适冷产黄青霉FS010木聚糖酶染色体基因的克隆
• 5.3.2 低温木聚糖酶cDNA基因的克隆
• 5.3.3 FS010低温木聚糖酶cDNA基因的序列分析
• 5.3.4 产黄青霉低温木聚糖酶cDNA基因的外源表达和纯化
• 5.3.5.重组低温木聚糖酶的酶学性质
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 全文总结
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表