粘质沙雷氏菌杀虫蛋白的分离纯化及其基因的克隆与表达研究

论文摘要

蝗虫是一种主要的草地害虫，对我国农牧业的造成了极大的损失，我国目前控制蝗虫危害的手段主要是采用化学药剂来降低虫口密度，但是过度的使用化学农药对环境造成了相当的危害，迫切需要采用一些生物防治手段来作为替代。因此，蝗虫的生物防治技术应运而生，并日益受到重视。 本实验从蝗虫自然病死虫尸中分离纯化得到一较高毒性的病原菌HR-3，通过形态学观察、生理生化特征分析和分子鉴定将其鉴定为为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens），为细菌杀虫剂的研究开发提供了新的菌株来源。微生物杀虫剂由于所使用的病原微生物不同，其杀虫原理和机制有所不同，粘质沙雷氏菌HR-3的杀虫活性实验表明，其杀虫活性物质是存在于细菌上清液中的杀虫蛋白。将细菌发酵上清液进行Milipore超滤，除去40kDa以下和80kDa以上的蛋白，获得40-80kDa的杀虫粗蛋白。进一步经过硫酸铵分级沉淀，DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析，Sephacryl S-200凝胶过滤，获得电泳纯的杀虫蛋白。每升发酵液中可获得约10ml杀虫蛋白溶液，冻干可获得4.5mg活性蛋白，SDS-PAGE电泳和凝胶过滤实验表明该杀虫蛋白为单体，分子量约为60kDa。 粘质沙雷氏菌分泌的许多著名的胞外蛋白，分别为核酸酶、磷脂酶、溶血素、含铁细胞、几丁质酶、含铁细胞、蛋白酶、脂肪酶，其中的一种或几种蛋白有可能是杀虫活力因子。通过酶活检测结果表明，纯化的杀虫蛋白仅具备蛋白酶活性，杀虫蛋白应是一种蛋白酶。用EDTA和1-10-phenanthrolin可以抑制杀

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 蝗虫病原菌分离鉴定及其杀虫蛋白的分离纯化
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 菌种鉴定结果
• 3.2 杀虫活性物质的确定
• 3.3 杀虫蛋白的纯化
• 3.4 杀虫蛋白的初步性质
• 3.5 杀虫蛋白的酶活实验结果
• 3.6 杀虫蛋白N-末端氨基酸序列分析
• 3.7 杀虫蛋白的毒性实验
• 4 讨论
• 4.1 杀虫蛋白的纯化方法
• 4.2 杀虫蛋白N-末端氨基酸序列与金属蛋白酶的同源性研究
• 4.3 杀虫蛋白在生物防治领域中的应用潜力和存在的问题
• 5 小结
• 6 参考文献
• 第二章 粘质沙雷氏菌HR-3发酵条件优化、诱变及其杀虫蛋白的酶学性质研究
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 发酵上清液蛋白酶活力检测
• 3.2 发酵工艺试验
• 2激光辐照选育'>3.3 CO₂激光辐照选育
• 3.4 杀虫蛋白的酶学性质研究
• 4 讨论
• 4.1 金属蛋白酶酶活力测定与筛选模型的建立
• 4.2 诱变方法的选择
• 4.3 蛋白质（酶）酶学性质与化学修饰的必要性
• 5 小结
• 6 参考文献
• 第三章 粘质沙雷氏菌杀虫蛋白基因的克隆和序列分析
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 杀虫蛋白基因PCR引物的设计
• 3.2 杀虫蛋白成熟肽编码区的PCR扩增和克隆鉴定
• 3.3 杀虫蛋白成熟肽编码区的序列分析
• 3.4 杀虫蛋白成熟肽编码区的同源性分析
• 3.5 杀虫蛋白成熟肽氨基酸序列同源性分析
• 3.6 杀虫蛋白成熟肽的C-末端氨基酸序列的同源性分析
• 3.7 沙虫蛋白成熟肽的Zn配体和活性位点的同源性分析
• 4 讨论
• 4.1 PCR法克隆杀虫蛋白成熟肽编码区的策略
• 4.2 杀虫蛋白成熟肽编码区的序列分析
• 4.3 杀虫蛋白成熟肽的分析
• 5 小结
• 6 参考文献
• 第四章 粘质沙雷氏菌杀虫蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 杀虫蛋白成熟肽编码序列在E.coli中的融合表达
• 3.2 杀虫蛋白成熟肽编码序列在E.coli中的非融合表达
• 4 讨论
• 4.1 诱导杀虫蛋白表达的优化
• 4.2 杀虫蛋白在大肠杆菌中的表达
• 4.3 包涵体的变性和折叠复性实验
• 5 小结
• 6 参考文献
• 文献综述 微生物金属蛋白酶研究进展
• 引言
• 1 金属蛋白酶特点和分类
• 2 微生物金属蛋白酶的来源与分布
• 2.1 微生物金属蛋白酶的来源
• 2.2 微生物金属蛋白酶的分布
• 3 微生物来源金属蛋白酶的生化性质
• 3.1 耐热金属蛋白酶
• 3.2 嗜冷金属蛋白酶
• 3.3 碱性条件的金属蛋白酶
• 3.4 溶葡球菌酶
• 4 微生物金属蛋白酶的结构
• 5 金属蛋白酶的基因克隆
• 5.1 典型金属蛋白酶比较
• 5.2 溶葡球菌酶克隆
• 5.3 肉毒毒素的克隆
• 6 作为细胞毒蛋白的微生物金属蛋白酶
• 6.1 鳗弧菌金属蛋白酶
• 6.2 脆弱类杆菌金属蛋白酶
• 6.3 嗜水气单胞菌金属蛋白酶
• 7 微生物金属蛋白酶的应用
• 7.1 微生物金属蛋白酶在食品业的应用
• 7.2 微生物金属蛋白酶在日用化工领域的应用
• 7.3 微生物金属蛋白酶在医药领域的应用
• 8 微生物金属蛋白酶的发展前景
• 参考文献
• 附：
• 致谢
• 论文发表及奖励