论文摘要
随着抗生素的大量应用,越来越多的病原菌产生了耐药性。寻找对耐药病原菌有活性的新型抗生素,已成为十分迫切的任务。红霉素为一类广谱大环内酯类抗生素,在临床上也出现了许多耐药病原菌。为寻找对耐药菌具有活性的新红霉素类抗生素药物,在对红霉素结构进行化学修饰的同时,也在积极探索通过基因工程途径对红霉素结构进行改造。 目前在临床上使用的特利霉素（telithromycin）为第三代红霉素,是使用化学方法对红霉素结构进行修饰的酮内酯类抗生素。其结构上最大的特点是大环内酯C-3位由原来的L-克拉定糖替换成了酮基。缺失了这个克拉定糖,酮内酯类能更易在内酯环其他位置衍生,另外酮基能避免诱导出大环内酯-林可酰胺-链阳霉素B（macrolide-lincosamide-streptogramin B,MLSB）抗性,大大提高了酮内酯类对某些红霉素耐药性菌株的抗菌活性。由于红霉素母核中的C-3位功能基团-OH是由其聚酮合成酶（polyketide synthase,PKS）模块6中的酮基还原酶（ketoreductase,KR）酶域决定,所以可利用基因工程方法改造KR6酶域DNA序列,使KR6酶域失活来生物合成酮内酯类。 在糖多孢红霉菌KR6酶域的NADPH结合保守区域中有五个重要氨基酸VSRRG,红霉菌聚酮合成酶模块3的KR3酶域可能就是因为没有这五个氨基酸而缺乏还原酮基的功能。本文利用染色体同源重组方法,将糖多孢红霉菌染色体上KR6酶域DNA序列中编码VSRRG中的SRR三个氨基酸的九个核苷酸敲除,获得了可合成酮内酯类3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B的糖多孢红霉菌突变体λC3-SRR,为下一步筛选有生物活性的酮内酯类抗生素奠定了基础。 以糖多孢红霉菌基因组DNA为模板,用重叠PCR技术扩增出敲除了SRR三个氨基酸相应九核苷酸序列的KR6酶域DNA片段,并克隆到同源重组载体pWHM3上,构建了质粒pWHM3-SRR。将pWHM3-SRR质粒转化到糖多孢红霉菌λC3菌株中,筛选出质粒整合到红霉素合成基因位点的整合体λC3-A、λC3-B和λC3-C。将λC3-A在无硫链丝菌肽（Thio）的R3M斜面上生长至少两代,制
论文目录
中文摘要Abstract目录缩略词表第一部分 引言第二部分 材料与方法1 材料1.1 菌种1.2 质粒1.3 培养基及培养条件1.4 缓冲液、展层剂、显色剂1.5 工具酶1.6 试剂及试剂盒1.7 仪器设备2 方法2.1 糖多孢红霉菌总DNA的小量提取制备2.2 糖多孢红霉菌总DNA的大量制备2.3 大肠杆菌质粒的小量提取2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化2.5 糖多孢红霉菌孢子的制备2.6 糖多孢红霉菌原生质体制备和转化2.7 DNA PCR扩增2.8 DNA限制性酶切2.9 DNA片段的连接2.10 DNA电泳分离2.11 DNA片段的回收和纯化2.12 发酵产物的提取2.13 发酵产物HPLC初步分离2.14 生物活性检测2.15 发酵产物质谱鉴定第三部分 结果与分析1 pUC-SRR质粒的构建1.1 引物设计1.2 pUC-SRR质粒的构建1.3 pUC-SRR质粒的鉴定2 pWHM3-SRR质粒的构建2.1 pWHM3-SRR质粒的构建2.2 pWHM3-SRR质粒的鉴定3 整合体λC3-A、λC3-B和λC3-C的筛选4 整合体λC3-A、λC3-B和λC3-C的鉴定5 λC3-A、λC3-B和λC3-C整合体质粒整合位点的确定5.1 λC3-A、λC3-B和λC3-C培养液的枯草杆菌抑制试验5.2 λC3-A、λC3-B和λC3-C发酵产物的薄层色谱分析5.3 整合体中pWHM3-SRR质粒在染色体上整合的示意图6 糖多孢红霉菌λC3-SRR菌株的筛选7 糖多孢红霉菌λC3-SRR发酵产物的鉴定7.1 糖多孢红霉菌λC3-SRR发酵产物的薄层色谱分析7.2 糖多孢红霉菌λC3-SRR发酵产物的质谱分析第四部分 讨论1 KR6酶域DNA序列定点突变体λC3-SRR与KR6酶域DNA序列完全敲除突变体M的质谱图比较2 KR6酶域与SDR家族的关系的研究3 对SRR三个氨基酸在KR6酶域结合NADPH过程中所发挥作用的研究4 对λC3-SRR发酵液质谱图中存在少量红霉素（ErA）特征质谱峰的解释第五部分 总结1 本研究主要获得的结果1.1 构建的糖多孢红霉菌λC3-SRR突变体合成了酮内酯类化合物3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B1.2 本研究突变位点处的两个精氨酸是KR6酶域的NADPH2′-磷酸结合位点1.3 敲除了SRR的KR6酶域可与NADPH微弱结合使得λC3-SRR突变体合成少量的红霉素1.4 糖多孢红霉菌λC3-SRR突变体发酵液中没有副产物2-脱甲基-3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B1.5 糖多孢红霉菌聚酮合成酶KR6酶域属于复合型SDR2 本论文的创新之处3 需进一步研究的问题论文参考文献附录（序列分析图谱）综述：红霉素抗菌机制及细菌产生红霉素抗性的机制综述参考文献致谢硕士期间发表论文
相关论文文献
标签：糖多孢红霉菌论文; 聚酮合成酶论文; 同源重组论文; 酮内酯类论文; 脱氧羰基红霉内酯论文;
