转基因抗烟嘧磺隆水稻的研究

论文摘要

烟嘧磺隆(Nicosulfuron)是一种超高效、广谱的磺酰脲类除草剂,大量用于玉米田苗后的杂草防治。对于玉米田中发生的多数一年生禾本科杂草、部分阔叶杂草及部分莎草科杂草具有较好的防治效果。烟嘧磺隆易被植物的根、叶吸收,在木质部和韧皮部传导,其作用靶标是乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthetase, ALS),而ALS是植物合成支链氨基酸撷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸的一个关键酶,由于ALS的活性严重受到抑制,导致缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸缺乏,影响植物细胞的有丝分裂,从而导致植物死亡。我国于20世纪90年代初期开始推广烟嘧磺隆,由于其除草效果突出、可混性强、用量低等优点而广受欢迎。本论文通过生物信息学技术,从玉米自交系B73基因组中选择了5个可能参与烟嘧磺隆降解的基因。其中一个基因导入到水稻以后使水稻获得了抗烟嘧磺隆的能力。这个基因被命名为253。转基因抗烟嘧磺隆水稻的抗性通过在大田六块田间区域内,以40mL/m2的使用量分别喷施80mg/L、160mg/L、320mg/L、480mg/L、640mg/L浓度的烟嘧磺隆和清水对照获得。结果表明253基因水稻植株在正常的玉米田内烟嘧磺隆除草剂使用浓度(80mg/L)下生长不受影响,部分转基因株系对烟嘧磺隆的抗性水平甚至可以达到640mg/L,大大超过了田间杂草防治的使用浓度。本研究获得的转基因水稻可以在苗后利用烟嘧磺隆防治杂草。烟嘧磺隆杀草效果好、成本低,因此本研究获得的转基因水稻具有重要应用价值。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 烟嘧磺隆的生产及其发展
• 1.1.1 烟嘧磺隆的生产
• 1.1.1.1 中间体磺酰胺的合成
• 1.1.1.2 磺酰胺和嘧啶胺的缩合
• 1.1.2 烟嘧磺隆的发展
• 1.2 烟嘧磺隆性质及作用机理
• 1.2.1 烟嘧磺隆的理化性质
• 1.2.2 烟嘧磺隆作用机理
• 1.2.3 烟嘧磺隆的降解
• 1.3 作物抗烟嘧磺隆的机理
• 1.4 烟嘧磺隆靶标酶ALS抑制剂的研究现状
• 1.4.1 ALS抑制剂的主要种类
• 1.4.1.1 磺酰脲类
• 1.4.1.2 咪唑啉酮类
• 1.4.1.3 三唑并嘧啶类
• 1.4.1.4 嘧啶水杨酸类
• 1.4.2 ALS抑制剂的作用机制
• 1.5 抗除草剂转基因水稻的研究现状
• 1.5.1 部分抗除草剂转基因在水稻等植物上的应用
• 1.5.1.1 抗EPSPS抑制剂基因的应用
• 1.5.1.2 抗ALS抑制剂基因的应用
• 1.5.1.3 细胞色素P450基因的应用
• 1.5.1.4 乙酰CoA转移酶基因的应用
• 1.5.2 转基因水稻的安全性
• 1.5.2.1 转基因水稻的食用安全
• 1.5.2.2 转基因水稻的生态安全
• 1.6 小结
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 常用实验菌株
• 2.1.3 常用试剂与仪器
• 2.1.4 常用实验溶液配置方法
• 2.2 方法
• 2.2.1 常用的分子生物学实验方法
• 2.2.1.1 PCR反应
• 2.2.1.2 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.1.3 凝胶回收
• 2.2.1.4 高保真酶扩增产物加A反应
• 2.2.1.5 连接反应
• 2.2.1.6 大肠杆菌TG1感受态细胞的制备及转化
• 2.2.1.7 质粒提取
• 2.2.1.8 酶切鉴定
• 2.2.1.9 农杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.1.10 植物总DNA的提取（CTAB法）
• 2.2.2 水稻转化表达载体的构建
• 2.2.2.1 253基因的获得
• 2.2.2.2 253基因的克隆鉴定及测序
• 2.2.2.3 抗烟嘧磺隆抗草甘膦基因水稻转化载体的构建
• 2.2.3 农杆菌介导的外源基因的转化
• 2.2.3.1 水稻成熟胚愈伤组织的诱导
• 2.2.3.2 农杆菌与水稻愈伤的共培养
• 2.2.3.3 抗性愈伤组织的筛选
• 2.2.3.4 转化植株的再生与培养
• 2.2.4 转基因水稻的PCR鉴定
• 2.2.5 转基因水稻部分植株生根阶段烟嘧磺隆抗性预分析
• 2.2.6 转基因水稻植株温室水培阶段烟嘧磺隆抗性分析
• 2.2.7 转基因水稻植株的田间烟嘧磺隆抗性分析
• 3 结果与分析
• 3.1 253基因的克隆与鉴定
• 3.2 转基因水稻植株的获得
• 3.3 转基因水稻的PCR鉴定
• 3.4 转基因水稻植株生根阶段烟嘧磺隆抗性预分析
• 3.5 转基因水稻植株温室水培阶段烟嘧磺隆抗性分析
• 3.6 转基因水稻植株的田间烟嘧磺隆抗性分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 作者简历
• 附录Ⅰ 常用的生化试剂及仪器
• 附录Ⅱ 常用的实验溶液配置方法