载脂蛋白E亚型对炎性刺激后施万细胞产生细胞因子和NO的特异性效应

论文摘要

近十余年的研究证明,载脂蛋白E（ApoE）在中枢神经系统自身免疫性疾病中具有重要的免疫调节功能。SCs作为周围神经髓鞘形成细胞在周围神经系统自身免疫性疾病中发挥重要作用,同时SCs也是被自身免疫反应攻击的目标。许多文献阐述了ApoE不同亚型在周围神经系统免疫性疾病中发挥的差异性作用。目前尚未有人研究不同基因型ApoE对于SCs在周围神经系统中免疫调节功能有何具体影响。在本次研究中,作者分别从人类ApoE2,ApoE3和ApoE4的转基因小鼠体内提取并培养SCs,以促炎因子脂多糖（LPS）联合干扰素（IFN）-γ施加刺激,然后应用流式细胞学、ELISA等技术比较不同系别小鼠的SCs在体外表达细胞因子,产生一氧化氮的情况,以探讨表达不同人类ApoE基因亚型的SCs在应对炎性刺激时的免疫应答。此外,作者还应用Western blot技术针对细胞信号传导通路做了进一步的研究,试图发现有哪些具体的分子参与到该免疫应答中。本研究发现炎性刺激后施万细胞的形态发生改变—体积变大,细胞突触减少,边缘变模糊。流式细胞仪检测结果显示本次实验中培养的施万细胞为同系细胞群。超过95%的施万细胞表达载脂蛋白E。另外,流式细胞仪针对抗-S100抗体的检测结果显示本次实验中培养的施万细胞纯度超过96%。ApoE3促进施万细胞产生IL-6、IL-10和NO。为深入研究不同亚型ApoE在应对炎性应答中的作用,我们对三种转基因鼠（ApoE2,ApoE3和ApoE4）的施万细胞内细胞因子水平（TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10）以及培养液上清中的细胞因子水平（仅IL-6,IL-10和NO）进行了检测。刺激前,流式细胞仪几乎无法探测到SCs胞内TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6以及IL-10的表达量。然而经LPS和IFN-γ刺激72小时后,上述5种细胞因子在各组小鼠的SCs内表达量明显提高。ApoE3转基因小鼠实验组的施万细胞胞内IL-6和IL-10的表达水平明显高于ApoE2和ApoE4组。各实验组中细胞外培养液上清中的IL-6,IL-10和NO相对浓度也随炎性刺激的加入而明显提高。ApoE4转基因小鼠SCs培养基上清中IL-6,IL-10和NO的产生量明显低于ApoE3组。另外炎性刺激前,流式细胞学方法未检测到SCs表达iNOS。而炎性刺激后,流式细胞仪检测出iNOS阳性的SCs比例超过99%。无论从阳性细胞率方面比较,还是从几何平均荧光强度比较,iNOS的表达量在各组间无显著性差异。ApoE亚型对共刺激分子和ApoE的表达无影响。在免疫炎性应答中,共刺激分子—如CD80、CD86、MHC-II,CD1d和TLR-4等—能否在施万细胞内或表面表达对免疫应答影响很大。炎性刺激前,这些分子几乎难以测得到,而在炎性刺激后,CD80、CD86、MHC-II,CD1d和TLR-4的表达量都有所上升。不过这些分子的表达水平没有组间显著性差异。不论是依靠流式细胞学技术检测平均荧光强度测得的SCs内表达的ApoE含量,还是依靠酶联免疫吸附试验（ELISA）测得的培养液上清中的ApoE浓度,都未发现组间存在显著性差异。ApoE3抑制信号传导通路中的NFκB和Akt的表达。我们选择了细胞内信号传导通路中的两个重要分子—NFκB和Akt作为研究对象,应用Western blot技术,试图通过对这两种分子在SCs内表达量的不同,探讨不同亚型的ApoE是如何发挥各自的作用的。结果显示,在炎性刺激后,ApoE3的NFκB表达量最低,其次是ApoE4和ApoE2。另外,ApoE3和ApoE4组在刺激后表达Akt分子的水平低于ApoE2组。结论:（1）在体外实验中,施万细胞是以一种ApoE亚型依赖的模式应对炎症刺激的。（2）在调控局部炎症应答过程中,ApoE3转基因小鼠的SCs比ApoE2和ApoE4转基因小鼠的SCs能够产生更多的细胞因子和NO,因而其免疫调控能力也更强。（3）本研究也许有利于从ApoE基因型的角度解释周围神经系统的炎症性疾病。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号标志和缩略词
• 第1章 绪论
• 1.1 载脂蛋白E 在自身免疫性神经病中的作用
• 1.2 施万细胞在周围神经免疫应答中的作用
• 1.3 本实验的设计思路与研究目的
• 第2章 不同ApoE 亚型施万细胞的培养及炎性刺激后形态改变的观察.
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 第3章 不同ApoE 亚型施万细胞经炎性刺激后胞内分子表达的改变
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 第4章 不同ApoE亚型施万细胞经炎性刺激后合成细胞因子和NO的改变
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.3 实验结果
• 第5章 炎性刺激后不同亚型ApoE 施万细胞胞内信号通路的研究
• 5.1 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.3 实验结果
• 第6章 讨论
• 6.1 ApoE3 促进施万细胞产生IL-6、IL-10 和NO
• 6.2 ApoE3 限制信号传导通路中的NFκB 和Akt 的表达
• 6.3 关于ApoE 对实验的干扰
• 第7章 结论
• 参考文献
• 作者简介及在学期间发表的论文
• 致谢