胚胎干细胞体外分化肝细胞的研究及一种新型祖细胞的鉴定

论文摘要

目前,胚胎干细胞体外诱导为肝细胞的主要途径是通过拟胚体启动ES细胞分化,再通过细胞因子与胞外基质协同作用等方法完成肝细胞的发育与成熟。由于拟胚体法得到的细胞异质程度高而且分化周期长,不利于细胞移植治疗。因此,通过体外培养的ES细胞直接分化为肝细胞的研究已丌始受到重视。本实验利用试剂A（药品代号）诱导,在不经过拟胚体的情况下,直接将ES细胞诱导分化为肝细胞,并探讨了该诱导分化过程中出现的一种具有多分化潜能的祖细胞的性质与功能。 实验分为两部分。第一部分为ES细胞在试剂A作用下向一种AFp+/Nestin+/CKl9+卵圆形样祖细胞的分化,并对这种祖细胞的性质进行鉴定。ES在2.5mM试剂A作用下,细胞形态发生明显变化,在试剂A处理6d之后,撤去试剂A继续培养7d,可观察到一种特殊类型的卵圆形细胞的出现。利用RT-PCR方法对这种细胞的mRNA表达进行检测,发现这种细胞表达AFP、CKl9和Nestin。免疫细胞化学检测,发现这种细胞AFP、CKl9和Nestin呈阳性,初步将这种细胞定义为AFP+/Nestin+/CKl9+祖细胞。 第二部分为上述试剂A诱导分化而成的AFP+/Nestin+/CKl9+祖细胞多方向分化潜能的鉴定。包括祖细胞向肝细胞的分化,向胆管上皮样细胞的分化和向神经细胞的分化。将AFP+/Nestin+/CKl9+祖细胞用两种包含不同浓度和不同细胞因子的肝细胞成熟培养液进行培养,一组培养液为低浓度的HGF、Dex和lTS组合,一组培养液为bFGF、Dex和较高浓度的HGF、OSM的组合。培养15d后,在低浓度因子处理组细胞中检测到TAT、HNF4和ALB等mRNA的表达,免疫组化和免疫荧光检测显示此细胞表达AFP和微弱的ALB,糖原合成PAS反应也呈阳性。而在高浓度因子处理组细胞中则检测到了ALB的强表达。将祖细胞培养在胞外基质Matrigel上,以含100ng/m1 HGF的William E培养液培养7d后观察发现祖细胞形成胆管上皮样结构。将祖细胞培养在含RA的培养液中,6d后观察发现具有明显丝状突起的神经样细胞。 因此,我们在试剂A诱导的ES细胞体外分化过程中,分离鉴定到了一种AF})+/Nestin+/CKl9+祖细胞,这种祖细胞在合适的培养条件和培养环境中,能分化为肝细胞、胆管上皮样细胞和神经样细胞,具有多分化潜能。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 1 胚胎干细胞的定义
• 2 胚胎干细胞的体内外定向分化研究
• 3 胚胎干细胞定向分化研究存在的问题
• 4 胚胎干细胞向肝细胞分化的研究
• 参考文献
• 第二部分 实验研究
• 引言
• 1 材料
• 1.1 细胞
• 1.2 实验动物
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要试剂
• 1.5 主要溶液的配制
• 1.6 主要引物序列
• 2 实验方法
• 2.1 小鼠胚胎成纤维细胞MEF饲养层细胞的制备
• 2.2 ES细胞的培养和传代
• 2.3 ES-D3细胞分化
• 2.4 祖细胞的鉴定
• 2.5 分化肝细胞的鉴定
• 3 结果
• 3.1 ES细胞的培养
• 3.2 试剂A对ES细胞的诱导作用
• +/Nestin⁺/CK19⁺祖细胞的增殖及性质鉴定'>3.3 AFP⁺/Nestin⁺/CK19⁺祖细胞的增殖及性质鉴定
• +/Nestin⁺/CK19⁺祖细胞向肝细胞的成熟'>3.4 AFP⁺/Nestin⁺/CK19⁺祖细胞向肝细胞的成熟
• +/Nestin⁺/CK19⁺祖细胞向胆管上皮细胞的分化'>3.5 AFP⁺/Nestin⁺/CK19⁺祖细胞向胆管上皮细胞的分化
• +/Nestin⁺/CK19⁺祖细胞向神经细胞的分化'>3.6 AFP⁺/Nestin⁺/CK19⁺祖细胞向神经细胞的分化
• 4 讨论
• 4.1 试剂A在ES-D3细胞分化过程中的作用
• +/Nestin⁺/CK19⁺祖细胞的分化'>4.2 ES-D3细胞向AFP⁺/Nestin⁺/CK19⁺祖细胞的分化
• +/Nestin⁺/CK19⁺祖细胞的多方向分化潜能'>4.3 AFP⁺/Nestin⁺/CK19⁺祖细胞的多方向分化潜能
• 5 结论与创新
• 参考文献
• 附录
• 学习期间发表的论文