草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究

论文摘要

草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus,GCRV）为双链分段RNA病毒,隶属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属,是引起草鱼出血病的主要病原,主要危害草鱼鱼种并引起草鱼出血病,严重影响我国淡水渔业的发展。本研究从患出血病的草鱼中分离草鱼呼肠孤病毒将其命名为GCRV096。提取病毒基因组RNA,运用同源序列扩增法获得vp5与vp7基因cDNA全长,并对其进行表达,而且研究了VP5、VP7蛋白的亚细胞定位。vp5基因cDNA全长为1981 bp,ORF为1947 bp,编码648个氨基酸,预测分子量为68.65 kDa,理论等电点为6.13。GCRV096 VP5氨基酸序列与金体美洲鳊鱼呼肠孤病毒（GSRV） VP4氨基酸序列、草鱼出血病病毒（GCHV） VP5氨基酸序列同源性较高,达90%以上。构建了vp5原核表达载体pET-VP5,在大肠杆菌BL21中成功诱导表达;重组蛋白主要以包涵体形式存在,通过His Trap? HP柱子纯化重组蛋白;Western blot分析结果表明所表达的蛋白为目的蛋白。构建了vp5基因的真核表达载体pEGFP-VP5,采用脂质体介导将重组质粒转染CIK细胞,转染24 h后在荧光显微镜中观察到VP5重组蛋白能在CIK细胞中瞬时表达,VP5重组蛋白在整个CIK细胞中都有分布,但主要分布在细胞核中。vp7基因cDNA全长为852 bp,ORF为831 bp,编码276个氨基酸,预测分子量约为29.85 kDa理论等电点为6.31。GCRV096 VP7氨基酸序列与沟鲶鱼呼肠孤病毒（CCRV）VP7氨基酸序列同源性最高,达100%。构建了vp7原核表达载体pET-VP7,在大肠杆菌BL21中成功诱导表达;重组蛋白主要以包涵体形式存在,通过His Trap? HP柱子纯化重组蛋白;Western blot分析结果表明所表达的蛋白为目的蛋白。构建了vp7基因的真核表达载体pEGFP-VP7采用脂质体介导将重组质粒转染CIK细胞,转染24 h后在荧光显微镜中观察到VP7重组蛋白分布在整个CIK细胞中,与pEGFP-N3的荧光分布形式趋于一致,具有细胞泛分布的特征。本研究丰富和发展了草鱼呼肠孤病毒的研究内容,为进一步研究VP5与VP7蛋白的生物学特性以及在介导病毒粒子进入宿主细胞功能研究奠定基础,为揭示GCRV的分子致病机理和预防治疗等研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 草鱼出血病的流行病学
• 1.2 GCRV 的发病机理
• 1.3 GCRV 的生物学特性
• 1.3.1 形态特征
• 1.3.2 理化特性
• 1.3.3 细胞培养及感染特性
• 1.4 GCRV 的分子生物学特征
• 1.4.1 GCRV 基因组结构
• 1.4.2 GCRV 基因节段及功能分析
• 1.4.3 GCRV 的转录和翻译
• 1.5 GCRV 的检测
• 1.6 草鱼出血病的防治
• 1.7 本研究的目的及意义
• 2 GCRV096 vp5 基因cDNA 的克隆、表达及VP5 蛋白亚细胞定位
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 病毒和细胞
• 2.1.3 主要试剂、工具酶及试剂盒
• 2.1.4 主要溶液和试剂的配制
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 vp5 基因cDNA 的克隆
• 2.2.2 vp5 基因的原核表达
• 2.2.3 VP5 的亚细胞定位
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 vp5 基因全长cDNA 序列的克隆
• 2.3.2 vp5 基因核苷酸与氨基酸序列特征分析
• 2.3.3 vp5 基因的原核表达
• 2.3.4 VP5 在CIK 细胞中的定位
• 2.4 讨论
• 3 GCRV096 vp7 基因cDNA 的克隆、表达及VP7 蛋白亚细胞定位
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 vp7 基因cDNA 的克隆
• 3.2.2 vp7 基因的原核表达
• 3.2.3 VP7 的亚细胞定位
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 vp7 基因全长cDNA 序列的克隆
• 3.3.2 vp7 基因核苷酸与氨基酸序列特征分析
• 3.3.3 vp7 基因的原核表达
• 3.3.4 VP7 在CIK 细胞中的定位
• 3.4 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 导师简介