1，3-丙二醇生物合成过程中的辅因子代谢调控

论文摘要

生物氧化还原反应具有选择性高、涉及产品多等特点,具有很大应用潜力,但生物氧化还原过程中辅酶的供给限制了其工业化应用。1,3-丙二醇生物合成过程是典型的生物还原反应,Klebsiella pneumoniae转化甘油生产1,3-丙二醇的过程需要消耗还原型辅酶NADH,在野生菌中它们是通过共存于菌体内的甘油氧化代谢途径再生的,但这种氧化-还原的耦联降低了甘油到1,3-丙二醇的转化率。本文以提高NADH的有效供给为目标,从削弱与1,3-丙二醇合成途径竞争NADH的途径,以及提高胞内NADH的再生能力两方面入手,探索了利用代谢工程手段促进1,3-丙二醇合成、尤其是提高产物得率的新方法。主要内容如下:（1）合成1,3-丙二醇的同时,分支代谢生成乙醇的过程消耗了大量辅酶。利用分子生物学方法,将K. pneumoniae YMU2中醛脱氢酶失活,构建了重组菌DA-1HB,该方法理论上可比改造乙醇脱氢酶更有效地削弱乙醇合成途径,从而减少副产物合成过程中NADH消耗。利用重组菌DA-1HB发酵罐培养时,1,3-丙二醇合成浓度达到61 g.l-1,比出发菌YMU2提高10%;乙醇合成浓度降低70%以上;1,3-丙二醇摩尔得率由35.5%提高到61.2%。（2）从提高胞内NADH再生能力角度,构建了携带甲酸脱氢酶基因的表达质粒,并转化到1,3-丙二醇生产菌YMU2中,重组菌OF-1利用甲酸/甲酸脱氢酶体系,胞内NADH再生能力得到有效提高。尽管摩尔得率（36%）与野生型菌株相似,但1,3-丙二醇浓度提高到68 g.l-1。（3）将上述“节流”“开源”的方式相结合,在醛脱氢酶失活菌株DA-1HB中克隆了甲酸脱氢酶,获得重组菌K. pneumoniae DAOF。1,3-丙二醇合成浓度及摩尔得率分别达到63 g.l-1及38.4%,该菌中乙醇合成浓度与YMU2相当,乙醇合成能力的恢复使得1,3-丙二醇合成未如预期般提高。（4）以1,3-PD合成性能占优的重组菌DA-1HB为工作菌株,调控培养基氧化还原态势,优化发酵工艺,以甘油为唯一碳源时,1,3-丙二醇合成浓度和摩尔得率分别达到70 g.l-1和69.9%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 1,3-丙二醇概述
• 1.3 1,3-丙二醇的研发及生产概况
• 1.4 生物法合成1,3-丙二醇的研究进展
• 1.5 生物氧化还原反应与辅因子代谢工程
• 1.6 本论文的研究意义和立题思想
• 1.7 本论文主要研究内容
• 第2章 培养基氧化还原态势调控对K. pneumoniae 代谢的影响
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料和方法
• 2.3 K. pneumoniae 菌体代谢途径理论分析
• 2.4 NADH 对K. pneumoniae 厌氧代谢的影响
• 2.5 K. pneumoniae 厌氧发酵过程中NAD 和NADH 的变化规律
• 2.6 利用电子受体调节培养基氧化还原态势对菌体生长代谢的影响
• 2.7 通过调节空气/氮气比例调控培养基氧化还原态势对K. pneumoniae生长代谢的影响
• 2.8 K. pneumonaie 厌氧代谢还原力分析
• 2.9 小结
• 第3章 在Klebsiella pneumoniae 中构建NADH 再生系统对1,3-丙二醇合成的影响
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料和方法
• 3.3 NADH 再生系统在Klebsiella pneumoniae 中的构建和鉴定
• 3.4 甲酸脱氢酶在基因工程菌K. pneumoniae OF-1 中的诱导表达
• 3.5 基因工程菌K. pneumoniae OF-1 的发酵研究
• 3.6 小结
• 第4章 醛脱氢酶基因敲除重组菌的构建及鉴定
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料和方法
• 4.3 构建醛脱氢酶基因敲除菌株的思路
• 4.4 醛脱氢酶基因的获取及中间载体pAL1 的构建
• 4.5 基因敲除标记的选取及醛脱氢酶基因敲除重组质粒的构建
• 4.6 同源重组构建醛脱氢酶基因缺失的重组菌
• 4.7 醛脱氢酶失活重组菌株的筛选及鉴定
• 4.8 重组菌DA-1H 的纯化筛选及初步发酵罐培养
• 4.9 小结
• 第5章 在醛脱氢酶失活菌中构建NADH 再生系统对1,3-丙二醇合成的影响
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料和方法
• 5.3 NADH 再生系统在K. pneumoniae DA-1HB 中的构建及鉴定
• 5.4 重组菌K. pneumoniae DAOF 中甲酸脱氢酶诱导表达及酶活测定
• 5.5 重组菌K. pneumoniae DAOF 厌氧发酵研究
• 5.6 小结
• 第6章 醛脱氢酶失活重组菌的发酵优化和代谢工程研究
• 6.1 前言
• 6.2 实验材料和方法
• 6.3 醛脱氢酶失活重组菌的生长代谢特性研究
• 6.4 醛脱氢酶失活重组菌DA-1HB 发酵罐培养
• 6.5 重组菌K. pneumoniae DA-1HB 代谢流分析
• 6.6 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A 主要实验仪器及试剂
• 附录B 基因序列
• 附录C 底物甘油及代谢产物HPLC 分析实验步骤及标准曲线
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果